Bölüm 1: Yönteme Genel Bakış

Yapay zeka destekli çeviri - daha fazla bilgi ve iyileştirme önerileri

Varyant çağırma, bir genom dizisindeki varyasyonları referans genoma göre belirlemeyi amaçlayan bir genomik analiz yöntemidir. Burada, tüm genom dizileme verilerinde kısa germline varyantları, yani SNP'ler ve indel'leri çağırmak için tasarlanmış araç ve yöntemleri kullanacağız.

Tam bir varyant çağırma pipeline'ı genellikle referansa haritalama (bazen genom hizalaması olarak da adlandırılır) ve varyant filtreleme ile önceliklendirme dahil olmak üzere pek çok adım içerir. Bu kursta işleri basit tutmak adına yalnızca varyant çağırma kısmına odaklanacağız.

Yöntemler

Tüm genom dizileme örneklerinde germline SNP'leri ve indel'leri belirlemek için varyant çağırmayı uygulamanın iki yolunu göstereceğiz. Önce, her örnekten bağımsız olarak varyant çağıran basit bir örnek başına yaklaşım ile başlayacağız. Ardından, birden fazla örneği birlikte analiz ederek daha doğru ve bilgilendirici sonuçlar üreten daha gelişmiş bir ortak çağırma yaklaşımını göstereceğiz.

Her iki yaklaşım için herhangi bir iş akışı kodu yazmaya başlamadan önce, komutları bazı test verileri üzerinde manuel olarak deneyeceğiz.

Veri Seti

Aşağıdaki veri ve ilgili kaynakları sağlıyoruz:

• Bir referans genomu: İnsan kromozom 20'sinin küçük bir bölgesinden (hg19/b37) oluşan ve yardımcı dosyalarını (indeks ve dizi sözlüğü) içeren referans genomu.
• Üç tüm genom dizileme örneği: Bir aile üçlüsüne (anne, baba ve oğul) karşılık gelen ve dosya boyutlarını küçük tutmak amacıyla kromozom 20 üzerinde küçük bir veri dilimine indirgenmiş örnekler. Bu, referans genoma önceden haritalanmış Illumina kısa okuma dizileme verisidir ve BAM formatında (Binary Alignment Map; SAM yani Sequence Alignment Map'in sıkıştırılmış bir sürümü) sağlanmaktadır.
• Genomik aralıklar listesi: Örneklerimizin varyant çağırmaya uygun veriye sahip olduğu genomdaki koordinatlar; BED formatında sağlanmaktadır.

Yazılım

Kullanılan iki ana araç şunlardır: Dizi hizalama dosyalarını işlemek için yaygın olarak kullanılan bir araç seti olan Samtools ve Broad Institute'ta geliştirilen varyant keşfi araçları seti olan GATK (Genome Analysis Toolkit).

Bu araçlar GitHub Codespaces ortamında kurulu değildir; bu nedenle Seqera Containers hizmeti aracılığıyla alınan konteynerler üzerinden kullanacağız (bkz. Hello Containers).

İpucu

pwd komutunu yazdığınızda gösterilen yolun son kısmının genomics olması için nf4-science/genomics dizininde olduğunuzdan emin olun.

---

1. Örnek Başına Varyant Çağırma

Örnek başına varyant çağırma, her örneği bağımsız olarak işler: varyant çağırıcı, bir seferde tek bir örneğin dizileme verilerini inceleyerek örneğin referanstan farklılaştığı konumları belirler.

Bu bölümde, örnek başına varyant çağırma yaklaşımını oluşturan iki komutu test ediyoruz: Samtools ile bir BAM dosyasını indeksleme ve GATK HaplotypeCaller ile varyant çağırma. Bu kursta Bölüm 2'de bir Nextflow iş akışına sarmalayacağımız komutlar bunlardır.

1. Samtools kullanarak bir BAM girdi dosyası için indeks dosyası oluşturma
2. VCF (Variant Call Format) formatında örnek başına varyant çağrıları üretmek için indekslenmiş BAM dosyası üzerinde GATK HaplotypeCaller'ı çalıştırma

Başlangıç olarak iki komutu yalnızca bir örnek üzerinde test ediyoruz.

1.1. Samtools ile BAM Girdi Dosyasını İndeksleme

İndeks dosyaları, biyoinformatik dosya formatlarının yaygın bir özelliğidir; GATK gibi araçların tüm dosyayı okumak zorunda kalmadan verinin bir alt kümesine erişmesini sağlayan, ana dosyanın yapısına ilişkin bilgiler içerirler. Bu dosyaların ne kadar büyük olabileceği göz önüne alındığında bu özellik büyük önem taşır.

BAM dosyaları çoğunlukla indeks olmadan sağlanır; bu nedenle pek çok analiz iş akışının ilk adımı samtools index kullanarak bir indeks oluşturmaktır.

Bir Samtools konteyneri indirip etkileşimli olarak başlatacak ve BAM dosyalarından biri üzerinde samtools index komutunu çalıştıracağız.

1.1.1. Samtools Konteynerini İndirme

Samtools konteyner imajını indirmek için docker pull komutunu çalıştırın:

docker pull community.wave.seqera.io/library/samtools:1.20--b5dfbd93de237464

Komut çıktısı

1.20--b5dfbd93de237464: Pulling from library/samtools
6360b3717211: Pull complete
2ec3f7ad9b3c: Pull complete
7716ca300600: Pull complete
4f4fb700ef54: Pull complete
8c61d418774c: Pull complete
03dae77ff45c: Pull complete
aab7f787139d: Pull complete
4f4fb700ef54: Pull complete
837d55536720: Pull complete
897362c12ca7: Pull complete
3893cbe24e91: Pull complete
d1b61e94977b: Pull complete
c72ff66fb90f: Pull complete
0e0388f29b6d: Pull complete
Digest: sha256:bbfc45b4f228975bde86cba95e303dd94ecf2fdacea5bfb2e2f34b0d7b141e41
Status: Downloaded newer image for community.wave.seqera.io/library/samtools:1.20--b5dfbd93de237464
community.wave.seqera.io/library/samtools:1.20--b5dfbd93de237464

Bu imajı daha önce indirmediyseniz tamamlanması bir dakika sürebilir. İşlem tamamlandığında konteyner imajının yerel bir kopyasına sahip olursunuz.

1.1.2. Samtools Konteynerini Etkileşimli Olarak Başlatma

Konteyneri etkileşimli olarak çalıştırmak için docker run komutunu -it bayraklarıyla kullanın. -v ./data:/data seçeneği, araçların girdi dosyalarına erişebilmesi için yerel data dizinini konteynere bağlar.

docker run -it -v ./data:/data community.wave.seqera.io/library/samtools:1.20--b5dfbd93de237464

Komut çıktısı

(base) root@1409896f77b1:/tmp#

İstemcinizin (base) root@a1b2c3d4e5f6:/tmp# gibi bir şeye dönüştüğünü fark edeceksiniz; bu, artık konteynerin içinde olduğunuzu gösterir.

/data/bam altındaki dizi verisi dosyalarını görebildiğinizi doğrulayın:

ls /data/bam

Komut çıktısı

reads_father.bam  reads_mother.bam  reads_mother.bam.bai  reads_son.bam

Artık ilk komutu denemeye hazırsınız.

1.1.3. İndeksleme Komutunu Çalıştırma

Samtools belgeleri, bir BAM dosyasını indekslemek için çalıştırılacak komut satırını bize verir. Yalnızca girdi dosyasını sağlamamız yeterlidir; araç, girdi dosya adına .bai ekleyerek çıktı için otomatik olarak bir ad oluşturacaktır.

samtools index komutunu bir veri dosyası üzerinde çalıştırın:

samtools index /data/bam/reads_mother.bam

Komut terminalde herhangi bir çıktı üretmez; ancak artık orijinal BAM girdi dosyasıyla aynı dizinde reads_mother.bam.bai adlı bir dosya görmeniz gerekir.

Dizin içeriği

data/bam/
├── reads_father.bam
├── reads_mother.bam
├── reads_mother.bam.bai
└── reads_son.bam

Bu, ilk adımın testini tamamlar.

1.1.4. Samtools Konteynerinden Çıkma

Konteynerden çıkmak için exit yazın.

exit

İstemciniz, konteyneri başlatmadan önceki haline dönmüş olmalıdır.

1.2. GATK HaplotypeCaller ile Varyant Çağırma

Az önce indekslediğimiz BAM dosyası üzerinde gatk HaplotypeCaller komutunu çalıştırmak istiyoruz.

1.2.1. GATK Konteynerini İndirme

Önce GATK konteyner imajını indirmek için docker pull komutunu çalıştıralım:

docker pull community.wave.seqera.io/library/gatk4:4.5.0.0--730ee8817e436867

Komut çıktısı

Bazı katmanlar, daha önce indirdiğimiz Samtools konteyner imajıyla paylaşıldığından Already exists olarak görünür.

4.5.0.0--730ee8817e436867: Pulling from library/gatk4
6360b3717211: Already exists
2ec3f7ad9b3c: Already exists
7716ca300600: Already exists
4f4fb700ef54: Already exists
8c61d418774c: Already exists
03dae77ff45c: Already exists
aab7f787139d: Already exists
4f4fb700ef54: Already exists
837d55536720: Already exists
897362c12ca7: Already exists
3893cbe24e91: Already exists
d1b61e94977b: Already exists
e5c558f54708: Pull complete
087cce32d294: Pull complete
Digest: sha256:e33413b9100f834fcc62fd5bc9edc1e881e820aafa606e09301eac2303d8724b
Status: Downloaded newer image for community.wave.seqera.io/library/gatk4:4.5.0.0--730ee8817e436867
community.wave.seqera.io/library/gatk4:4.5.0.0--730ee8817e436867

İki konteyner imajı katmanlarının büyük bölümünü paylaştığından bu işlem ilk indirmeden daha hızlı olacaktır.

1.2.2. GATK Konteynerini Etkileşimli Olarak Başlatma

Samtools için yaptığımız gibi, veri dizini bağlı şekilde GATK konteynerini etkileşimli olarak başlatın.

docker run -it -v ./data:/data community.wave.seqera.io/library/gatk4:4.5.0.0--730ee8817e436867

İstemciniz, artık GATK konteynerinin içinde olduğunuzu gösterecek şekilde değişir.

1.2.3. Varyant Çağırma Komutunu Çalıştırma

GATK belgeleri, bir BAM dosyası üzerinde varyant çağırma işlemi gerçekleştirmek için çalıştırılacak komut satırını bize verir.

BAM girdi dosyasını (-I), referans genomunu (-R), çıktı dosyası için bir ad (-O) ve analiz edilecek genomik aralıkların listesini (-L) sağlamamız gerekir.

Ancak indeks dosyasının yolunu belirtmemize gerek yoktur; araç, yerleşik adlandırma ve birlikte konumlandırma kuralına dayanarak onu aynı dizinde otomatik olarak arayacaktır. Aynı durum referans genomun yardımcı dosyaları (indeks ve dizi sözlüğü dosyaları, *.fai ve *.dict) için de geçerlidir.

gatk HaplotypeCaller \
        -R /data/ref/ref.fasta \
        -I /data/bam/reads_mother.bam \
        -O /data/vcf/reads_mother.vcf \
        -L /data/ref/intervals.bed

Komut çıktısı

Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar HaplotypeCaller -R /data/ref/ref.fasta -I /data/bam/reads_mother.bam -O reads_mother.vcf -L /data/ref/intervals.bed
00:27:50.687 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
00:27:50.854 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
00:27:50.858 INFO  HaplotypeCaller - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
00:27:50.858 INFO  HaplotypeCaller - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
00:27:50.858 INFO  HaplotypeCaller - Executing as root@a1fe8ff42d07 on Linux v6.10.14-linuxkit amd64
00:27:50.858 INFO  HaplotypeCaller - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
00:27:50.859 INFO  HaplotypeCaller - Start Date/Time: February 8, 2026 at 12:27:50 AM GMT
00:27:50.859 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
00:27:50.859 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
00:27:50.861 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Version: 4.1.0
00:27:50.861 INFO  HaplotypeCaller - Picard Version: 3.1.1
00:27:50.861 INFO  HaplotypeCaller - Built for Spark Version: 3.5.0
00:27:50.862 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
00:27:50.862 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
00:27:50.862 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
00:27:50.863 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
00:27:50.864 INFO  HaplotypeCaller - Deflater: IntelDeflater
00:27:50.864 INFO  HaplotypeCaller - Inflater: IntelInflater
00:27:50.864 INFO  HaplotypeCaller - GCS max retries/reopens: 20
00:27:50.864 INFO  HaplotypeCaller - Requester pays: disabled
00:27:50.865 INFO  HaplotypeCaller - Initializing engine
00:27:50.991 INFO  FeatureManager - Using codec BEDCodec to read file file:///data/ref/intervals.bed
00:27:51.016 INFO  IntervalArgumentCollection - Processing 6369 bp from intervals
00:27:51.029 INFO  HaplotypeCaller - Done initializing engine
00:27:51.040 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_utils.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_utils.so
00:27:51.042 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_smithwaterman.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_smithwaterman.so
00:27:51.042 INFO  SmithWatermanAligner - Using AVX accelerated SmithWaterman implementation
00:27:51.046 INFO  HaplotypeCallerEngine - Disabling physical phasing, which is supported only for reference-model confidence output
00:27:51.063 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_pairhmm_omp.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_pairhmm_omp.so
00:27:51.085 INFO  IntelPairHmm - Flush-to-zero (FTZ) is enabled when running PairHMM
00:27:51.086 INFO  IntelPairHmm - Available threads: 10
00:27:51.086 INFO  IntelPairHmm - Requested threads: 4
00:27:51.086 INFO  PairHMM - Using the OpenMP multi-threaded AVX-accelerated native PairHMM implementation
00:27:51.128 INFO  ProgressMeter - Starting traversal
00:27:51.136 INFO  ProgressMeter -        Current Locus  Elapsed Minutes     Regions Processed   Regions/Minute
00:27:51.882 WARN  InbreedingCoeff - InbreedingCoeff will not be calculated at position 20_10037292_10066351:3480 and possibly subsequent; at least 10 samples must have called genotypes
00:27:52.969 INFO  HaplotypeCaller - 7 read(s) filtered by: MappingQualityReadFilter
0 read(s) filtered by: MappingQualityAvailableReadFilter
0 read(s) filtered by: MappedReadFilter
0 read(s) filtered by: NotSecondaryAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: NotDuplicateReadFilter
0 read(s) filtered by: PassesVendorQualityCheckReadFilter
0 read(s) filtered by: NonZeroReferenceLengthAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: GoodCigarReadFilter
0 read(s) filtered by: WellformedReadFilter
7 total reads filtered out of 1867 reads processed
00:27:52.971 INFO  ProgressMeter - 20_10037292_10066351:13499              0.0                    35           1145.7
00:27:52.971 INFO  ProgressMeter - Traversal complete. Processed 35 total regions in 0.0 minutes.
00:27:52.976 INFO  VectorLoglessPairHMM - Time spent in setup for JNI call : 0.003346916
00:27:52.976 INFO  PairHMM - Total compute time in PairHMM computeLogLikelihoods() : 0.045731709
00:27:52.977 INFO  SmithWatermanAligner - Total compute time in native Smith-Waterman : 0.02 sec
00:27:52.981 INFO  HaplotypeCaller - Shutting down engine
[February 8, 2026 at 12:27:52 AM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.walkers.haplotypecaller.HaplotypeCaller done. Elapsed time: 0.04 minutes.
Runtime.totalMemory()=203423744

Günlük çıktısı oldukça ayrıntılıdır; bu nedenle yukarıdaki örnekte en ilgili satırları vurguladık.

Çıktı dosyaları olan reads_mother.vcf ve indeks dosyası reads_mother.vcf.idx, konteynerdeki çalışma dizininizde oluşturulur.

Dizin içeriği

conda.yml  hsperfdata_root  reads_mother.vcf  reads_mother.vcf.idx

VCF dosyası varyant çağrılarını içerir; bunu birazdan göreceğiz. İndeks dosyası ise BAM indeks dosyasıyla aynı işlevi görür: araçların tüm dosyayı yüklemeden verinin alt kümelerini aramasına ve almasına olanak tanır.

VCF metin tabanlı bir format olduğundan ve bu dosya küçük bir test dosyası olduğundan, içeriğini açıp görüntülemek için cat reads_mother.vcf komutunu çalıştırabilirsiniz. Dosyanın başına kadar geri dönerseniz, pek çok meta veri satırından oluşan bir başlık ve ardından her biri bir satırda yer alan varyant çağrılarının listesini bulacaksınız.

Dosya içeriği (kısaltılmış)

##fileformat=VCFv4.2
##FILTER=<ID=LowQual,Description="Low quality">
##FORMAT=<ID=AD,Number=R,Type=Integer,Description="Allelic depths for the ref and alt alleles in the order listed">
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth (reads with MQ=255 or with bad mates are filtered)">
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">
##FORMAT=<ID=PL,Number=G,Type=Integer,Description="Normalized, Phred-scaled likelihoods for genotypes as defined in the VCF specification">
##GATKCommandLine=<ID=HaplotypeCaller,CommandLine="HaplotypeCaller --output reads_mother.vcf --intervals /data/ref/intervals.bed --input /data/bam/reads_mother.bam --reference /data/ref/ref.fasta [abridged]",Version="4.5.0.0",Date="February 11, 2026 at 4:23:43 PM GMT">
##INFO=<ID=AC,Number=A,Type=Integer,Description="Allele count in genotypes, for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=AF,Number=A,Type=Float,Description="Allele Frequency, for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=AN,Number=1,Type=Integer,Description="Total number of alleles in called genotypes">
##INFO=<ID=BaseQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt Vs. Ref base qualities">
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth; some reads may have been filtered">
##INFO=<ID=ExcessHet,Number=1,Type=Float,Description="Phred-scaled p-value for exact test of excess heterozygosity">
##INFO=<ID=FS,Number=1,Type=Float,Description="Phred-scaled p-value using Fisher's exact test to detect strand bias">
##INFO=<ID=InbreedingCoeff,Number=1,Type=Float,Description="Inbreeding coefficient as estimated from the genotype likelihoods per-sample when compared against the Hardy-Weinberg expectation">
##INFO=<ID=MLEAC,Number=A,Type=Integer,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele counts (not necessarily the same as the AC), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MLEAF,Number=A,Type=Float,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele frequency (not necessarily the same as the AF), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MQ,Number=1,Type=Float,Description="RMS Mapping Quality">
##INFO=<ID=MQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score From Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read mapping qualities">
##INFO=<ID=QD,Number=1,Type=Float,Description="Variant Confidence/Quality by Depth">
##INFO=<ID=ReadPosRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read position bias">
##INFO=<ID=SOR,Number=1,Type=Float,Description="Symmetric Odds Ratio of 2x2 contingency table to detect strand bias">
##contig=<ID=20_10037292_10066351,length=29059>
##source=HaplotypeCaller
#CHROM  POS     ID      REF     ALT     QUAL    FILTER  INFO    FORMAT  reads_mother
20_10037292_10066351    3480    .       C       CT      503.03  .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=23;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=27.95;SOR=1.179     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,18:18:54:517,54,0
20_10037292_10066351    3520    .       AT      A       609.03  .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=18;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=33.83;SOR=0.693     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,18:18:54:623,54,0
20_10037292_10066351    3529    .       T       A       155.64  .       AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=-0.544;DP=21;ExcessHet=0.0000;FS=1.871;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.000;QD=7.78;ReadPosRankSum=-1.158;SOR=1.034       GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:12,8:20:99:163,0,328
20_10037292_10066351    4012    .       C       T       1398.06 .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=44;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=32.51;SOR=0.739     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,43:43:99:1412,129,0
20_10037292_10066351    4409    .       A       ATATG   710.03  .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=31;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=30.87;SOR=0.784     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,23:23:69:724,69,0
20_10037292_10066351    5027    .       C       T       784.06  .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=27;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=30.16;SOR=0.693     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,26:26:77:798,77,0
20_10037292_10066351    5469    .       A       G       1297.06 .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=42;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=30.88;SOR=1.005     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,42:42:99:1311,126,0
20_10037292_10066351    7557    .       A       G       935.06  .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=36;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=27.50;SOR=0.693     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,34:34:99:949,100,0
20_10037292_10066351    7786    .       G       T       1043.06 .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=35;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=30.68;SOR=0.941     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,34:34:99:1057,102,0
20_10037292_10066351    8350    .       G       C       1162.06 .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=39;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=29.80;SOR=1.096     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,39:39:99:1176,115,0
20_10037292_10066351    8886    .       AAGAAAGAAAG     A       1268.03 .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=34;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=25.36;SOR=1.071     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,29:29:88:1282,88,0
20_10037292_10066351    13536   .       T       C       437.64  .       AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=1.454;DP=45;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.000;QD=9.95;ReadPosRankSum=-1.613;SOR=0.818        GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:26,18:44:99:445,0,672
20_10037292_10066351    14156   .       T       C       183.64  .       AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=0.703;DP=20;ExcessHet=0.0000;FS=1.871;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.000;QD=9.18;ReadPosRankSum=-0.193;SOR=1.034        GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:12,8:20:99:191,0,319

Yukarıdaki örnek çıktıda, ardından gelen tablo verilerinin sütun adlarını veren son başlık satırını vurguladık. Her veri satırı, örneğin dizileme verilerinde tespit edilen olası bir varyantı tanımlar. VCF formatını yorumlamaya ilişkin rehberlik için bu faydalı makaleye bakabilirsiniz.

1.2.4. Çıktı Dosyalarını Taşıma

Konteynerin içinde kalan her şey gelecekteki çalışmalar için erişilemez olacaktır. BAM indeks dosyası doğrudan bağlı dosya sistemindeki /data/bam dizininde oluşturuldu; ancak VCF dosyası ve indeksi oluşturulmadı; bu nedenle bu iki dosyayı manuel olarak taşımamız gerekiyor.

mkdir /data/vcf
mv reads_mother.vcf* /data/vcf

Dizin içeriği

data/
├── bam
│   ├── reads_father.bam
│   ├── reads_mother.bam
│   ├── reads_mother.bam.bai
│   └── reads_son.bam
├── ref
│   ├── intervals.bed
│   ├── ref.dict
│   ├── ref.fasta
│   └── ref.fasta.fai
├── samplesheet.csv
└── vcf
    ├── reads_mother.vcf
    └── reads_mother.vcf.idx

Bu işlem tamamlandığında tüm dosyalar normal dosya sisteminizde erişilebilir hale gelir.

1.2.5. GATK Konteynerinden Çıkma

Konteynerden çıkmak için exit yazın.

exit

İstemciniz normale dönmüş olmalıdır. Bu, örnek başına varyant çağırma testini tamamlar.

Bir iş akışı olarak yazın!

Bu analizi bir Nextflow iş akışı olarak uygulamaya başlamak istiyorsanız doğrudan Bölüm 2'ye geçebilirsiniz. Bölüm 3'e geçmeden önce ikinci test turunu tamamlamak için geri dönmeniz yeterli olacaktır.

---

2. Bir Kohort Üzerinde Ortak Çağırma

Az önce kullandığımız varyant çağırma yaklaşımı, örnek başına varyant çağrıları üretir. Her örneğin varyantlarına ayrı ayrı bakmak için bu yeterlidir; ancak sınırlı bilgi sağlar. Varyant çağrılarının birden fazla örnek arasında nasıl farklılaştığına bakmak çoğunlukla daha ilgi çekicidir. GATK bu amaç için ortak varyant çağırma adı verilen alternatif bir yöntem sunar.

Ortak varyant çağırma; her örnek için GVCF (Genomic VCF) adı verilen özel bir varyant çıktısı oluşturmayı, ardından tüm örneklerin GVCF verilerini birleştirmeyi ve bir 'ortak genotipleme' istatistiksel analizi çalıştırmayı kapsar.

Bir örneğin GVCF'sini özel kılan şey, yalnızca programın varyasyon kanıtı bulduğu konumları değil, genomun hedeflenen alanındaki tüm konumlara ilişkin dizi verisi istatistiklerini özetleyen kayıtlar içermesidir. Bu, ortak genotipleme hesaplaması için kritik öneme sahiptir (daha fazla okuma).

GVCF, az önce test ettiğimiz araç olan GATK HaplotypeCaller tarafından ek bir parametre (-ERC GVCF) ile üretilir. GVCF'lerin birleştirilmesi, örnek başına çağrıları bir veri deposunda (veritabanına benzer şekilde) birleştiren GATK GenomicsDBImport ile yapılır. Asıl 'ortak genotipleme' analizi ise GATK GenotypeGVCFs ile gerçekleştirilir.

Burada GVCF'leri oluşturmak ve ortak genotipleme çalıştırmak için gereken komutları test ediyoruz. Bu kursta Bölüm 3'te bir Nextflow iş akışına sarmalayacağımız komutlar bunlardır.

1. Samtools kullanarak her BAM girdi dosyası için indeks dosyası oluşturma
2. Örnek başına genomik varyant çağrılarının GVCF'sini oluşturmak için her BAM girdi dosyası üzerinde GATK HaplotypeCaller'ı çalıştırma
3. Tüm GVCF'leri toplayıp bir GenomicsDB veri deposunda birleştirme
4. Kohort düzeyinde bir VCF üretmek için birleştirilmiş GVCF veri deposu üzerinde ortak genotipleme çalıştırma

Şimdi üç BAM dosyasının tamamını indekslemekten başlayarak bu komutların hepsini test etmemiz gerekiyor.

2.1. Üç Örneğin Tamamı İçin BAM Dosyalarını İndeksleme

Yukarıdaki ilk bölümde yalnızca bir BAM dosyasını indeksledik. Şimdi GATK HaplotypeCaller'ın bunları işleyebilmesi için üç örneğin tamamını indeklememiz gerekiyor.

2.1.1. Samtools Konteynerini Etkileşimli Olarak Başlatma

Samtools konteyner imajını zaten indirdik; bu nedenle doğrudan başlatabiliriz:

docker run -it -v ./data:/data community.wave.seqera.io/library/samtools:1.20--b5dfbd93de237464

İstemciniz, daha önce olduğu gibi veri dizini bağlı şekilde konteynerin içinde olduğunuzu gösterecek şekilde değişir.

2.1.2. İndeksleme Komutunu Üç Örneğin Tamamında Çalıştırma

İndeksleme komutunu üç BAM dosyasının her birinde çalıştırın:

samtools index /data/bam/reads_mother.bam
samtools index /data/bam/reads_father.bam
samtools index /data/bam/reads_son.bam

Dizin içeriği

data/bam/
├── reads_father.bam
├── reads_father.bam.bai
├── reads_mother.bam
├── reads_mother.bam.bai
├── reads_son.bam
└── reads_son.bam.bai

Bu işlem, indeks dosyalarını ilgili BAM dosyalarıyla aynı dizinde oluşturmalıdır.

2.1.3. Samtools Konteynerinden Çıkma

Konteynerden çıkmak için exit yazın.

exit

İstemciniz normale dönmüş olmalıdır.

2.2. Üç Örneğin Tamamı İçin GVCF Oluşturma

Ortak genotipleme adımını çalıştırmak için üç örneğin tamamına ait GVCF'lere ihtiyacımız var.

2.2.1. GATK Konteynerini Etkileşimli Olarak Başlatma

GATK konteyner imajını daha önce indirdik; bu nedenle doğrudan başlatabiliriz:

docker run -it -v ./data:/data community.wave.seqera.io/library/gatk4:4.5.0.0--730ee8817e436867

İstemciniz, GATK konteynerinin içinde olduğunuzu gösterecek şekilde değişir.

2.2.2. GVCF Seçeneğiyle Varyant Çağırma Komutunu Çalıştırma

Genomik bir VCF (GVCF) üretmek için temel komuta -ERC GVCF seçeneğini ekliyoruz; bu seçenek HaplotypeCaller'ın GVCF modunu etkinleştirir.

Ayrıca çıktı dosyasının uzantısını .vcf'den .g.vcf'ye değiştiriyoruz. Bu teknik olarak zorunlu değildir; ancak güçlü biçimde önerilen bir kuraldır.

gatk HaplotypeCaller \
        -R /data/ref/ref.fasta \
        -I /data/bam/reads_mother.bam \
        -O reads_mother.g.vcf \
        -L /data/ref/intervals.bed \
        -ERC GVCF

Komut çıktısı

Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar HaplotypeCaller -R /data/ref/ref.fasta -I /data/bam/reads_mother.bam -O reads_mother.g.vcf -L /data/ref/intervals.bed -ERC GVCF
16:51:00.620 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
16:51:00.749 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
16:51:00.751 INFO  HaplotypeCaller - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
16:51:00.751 INFO  HaplotypeCaller - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
16:51:00.751 INFO  HaplotypeCaller - Executing as root@be1a0302f6c7 on Linux v6.8.0-1030-azure amd64
16:51:00.751 INFO  HaplotypeCaller - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
16:51:00.752 INFO  HaplotypeCaller - Start Date/Time: February 11, 2026 at 4:51:00 PM GMT
16:51:00.752 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
16:51:00.752 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
16:51:00.752 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Version: 4.1.0
16:51:00.753 INFO  HaplotypeCaller - Picard Version: 3.1.1
16:51:00.753 INFO  HaplotypeCaller - Built for Spark Version: 3.5.0
16:51:00.753 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
16:51:00.753 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
16:51:00.753 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
16:51:00.754 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
16:51:00.754 INFO  HaplotypeCaller - Deflater: IntelDeflater
16:51:00.754 INFO  HaplotypeCaller - Inflater: IntelInflater
16:51:00.754 INFO  HaplotypeCaller - GCS max retries/reopens: 20
16:51:00.754 INFO  HaplotypeCaller - Requester pays: disabled
16:51:00.755 INFO  HaplotypeCaller - Initializing engine
16:51:00.893 INFO  FeatureManager - Using codec BEDCodec to read file file:///data/ref/intervals.bed
16:51:00.905 INFO  IntervalArgumentCollection - Processing 6369 bp from intervals
16:51:00.910 INFO  HaplotypeCaller - Done initializing engine
16:51:00.912 INFO  HaplotypeCallerEngine - Tool is in reference confidence mode and the annotation, the following changes will be made to any specified annotations: 'StrandBiasBySample' will be enabled. 'ChromosomeCounts', 'FisherStrand', 'StrandOddsRatio' and 'QualByDepth' annotations have been disabled
16:51:00.917 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_utils.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_utils.so
16:51:00.919 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_smithwaterman.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_smithwaterman.so
16:51:00.919 INFO  SmithWatermanAligner - Using AVX accelerated SmithWaterman implementation
16:51:00.923 INFO  HaplotypeCallerEngine - Standard Emitting and Calling confidence set to -0.0 for reference-model confidence output
16:51:00.923 INFO  HaplotypeCallerEngine - All sites annotated with PLs forced to true for reference-model confidence output
16:51:00.933 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_pairhmm_omp.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_pairhmm_omp.so
16:51:00.945 INFO  IntelPairHmm - Flush-to-zero (FTZ) is enabled when running PairHMM
16:51:00.945 INFO  IntelPairHmm - Available threads: 4
16:51:00.945 INFO  IntelPairHmm - Requested threads: 4
16:51:00.945 INFO  PairHMM - Using the OpenMP multi-threaded AVX-accelerated native PairHMM implementation
16:51:00.984 INFO  ProgressMeter - Starting traversal
16:51:00.985 INFO  ProgressMeter -        Current Locus  Elapsed Minutes     Regions Processed   Regions/Minute
16:51:01.452 WARN  InbreedingCoeff - InbreedingCoeff will not be calculated at position 20_10037292_10066351:3480 and possibly subsequent; at least 10 samples must have called genotypes
16:51:02.358 INFO  HaplotypeCaller - 7 read(s) filtered by: MappingQualityReadFilter
0 read(s) filtered by: MappingQualityAvailableReadFilter
0 read(s) filtered by: MappedReadFilter
0 read(s) filtered by: NotSecondaryAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: NotDuplicateReadFilter
0 read(s) filtered by: PassesVendorQualityCheckReadFilter
0 read(s) filtered by: NonZeroReferenceLengthAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: GoodCigarReadFilter
0 read(s) filtered by: WellformedReadFilter
7 total reads filtered out of 1867 reads processed
16:51:02.359 INFO  ProgressMeter - 20_10037292_10066351:13499              0.0                    35           1529.5
16:51:02.359 INFO  ProgressMeter - Traversal complete. Processed 35 total regions in 0.0 minutes.
16:51:02.361 INFO  VectorLoglessPairHMM - Time spent in setup for JNI call : 0.0022800000000000003
16:51:02.361 INFO  PairHMM - Total compute time in PairHMM computeLogLikelihoods() : 0.061637120000000004
16:51:02.361 INFO  SmithWatermanAligner - Total compute time in native Smith-Waterman : 0.02 sec
16:51:02.362 INFO  HaplotypeCaller - Shutting down engine
[February 11, 2026 at 4:51:02 PM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.walkers.haplotypecaller.HaplotypeCaller done. Elapsed time: 0.03 minutes.
Runtime.totalMemory()=257949696

Bu işlem, konteynerdeki geçerli çalışma dizininde reads_mother.g.vcf GVCF çıktı dosyasını ve indeks dosyası olan reads_mother.g.vcf.idx'i oluşturur.

Dizin içeriği

conda.yml  hsperfdata_root  reads_mother.g.vcf  reads_mother.g.vcf.idx

Dosya içeriğinin ilk 200 satırını görüntülemek için head -200 reads_mother.g.vcf komutunu çalıştırırsanız, dosyanın ilk bölümde oluşturduğumuz eşdeğer VCF'den çok daha uzun olduğunu ve satırların büyük bölümünün VCF'de gördüklerimizden oldukça farklı göründüğünü fark edeceksiniz.

Dosya içeriği (kısaltılmış)

##fileformat=VCFv4.2
##ALT=<ID=NON_REF,Description="Represents any possible alternative allele not already represented at this location by REF and ALT">
##FILTER=<ID=LowQual,Description="Low quality">
##FORMAT=<ID=AD,Number=R,Type=Integer,Description="Allelic depths for the ref and alt alleles in the order listed">
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth (reads with MQ=255 or with bad mates are filtered)">
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">
##FORMAT=<ID=MIN_DP,Number=1,Type=Integer,Description="Minimum DP observed within the GVCF block">
##FORMAT=<ID=PGT,Number=1,Type=String,Description="Physical phasing haplotype information, describing how the alternate alleles are phased in relation to one another; will always be heterozygous and is not intended to describe called alleles">
##FORMAT=<ID=PID,Number=1,Type=String,Description="Physical phasing ID information, where each unique ID within a given sample (but not across samples) connects records within a phasing group">
##FORMAT=<ID=PL,Number=G,Type=Integer,Description="Normalized, Phred-scaled likelihoods for genotypes as defined in the VCF specification">
##FORMAT=<ID=PS,Number=1,Type=Integer,Description="Phasing set (typically the position of the first variant in the set)">
##FORMAT=<ID=SB,Number=4,Type=Integer,Description="Per-sample component statistics which comprise the Fisher's Exact Test to detect strand bias.">
##GATKCommandLine=<ID=HaplotypeCaller,CommandLine="HaplotypeCaller --emit-ref-confidence GVCF --output reads_mother.g.vcf --intervals /data/ref/intervals.bed --input /data/bam/reads_mother.bam --reference /data/ref/ref.fasta [abridged]",Version="4.5.0.0",Date="February 11, 2026 at 4:51:00 PM GMT">
##GVCFBlock0-1=minGQ=0(inclusive),maxGQ=1(exclusive)
##GVCFBlock1-2=minGQ=1(inclusive),maxGQ=2(exclusive)
##GVCFBlock10-11=minGQ=10(inclusive),maxGQ=11(exclusive)
##GVCFBlock11-12=minGQ=11(inclusive),maxGQ=12(exclusive)
##GVCFBlock12-13=minGQ=12(inclusive),maxGQ=13(exclusive)
##GVCFBlock13-14=minGQ=13(inclusive),maxGQ=14(exclusive)
##GVCFBlock14-15=minGQ=14(inclusive),maxGQ=15(exclusive)
##GVCFBlock15-16=minGQ=15(inclusive),maxGQ=16(exclusive)
##GVCFBlock16-17=minGQ=16(inclusive),maxGQ=17(exclusive)
##GVCFBlock17-18=minGQ=17(inclusive),maxGQ=18(exclusive)
##GVCFBlock18-19=minGQ=18(inclusive),maxGQ=19(exclusive)
##GVCFBlock19-20=minGQ=19(inclusive),maxGQ=20(exclusive)
##GVCFBlock2-3=minGQ=2(inclusive),maxGQ=3(exclusive)
##GVCFBlock20-21=minGQ=20(inclusive),maxGQ=21(exclusive)
##GVCFBlock21-22=minGQ=21(inclusive),maxGQ=22(exclusive)
##GVCFBlock22-23=minGQ=22(inclusive),maxGQ=23(exclusive)
##GVCFBlock23-24=minGQ=23(inclusive),maxGQ=24(exclusive)
##GVCFBlock24-25=minGQ=24(inclusive),maxGQ=25(exclusive)
##GVCFBlock25-26=minGQ=25(inclusive),maxGQ=26(exclusive)
##GVCFBlock26-27=minGQ=26(inclusive),maxGQ=27(exclusive)
##GVCFBlock27-28=minGQ=27(inclusive),maxGQ=28(exclusive)
##GVCFBlock28-29=minGQ=28(inclusive),maxGQ=29(exclusive)
##GVCFBlock29-30=minGQ=29(inclusive),maxGQ=30(exclusive)
##GVCFBlock3-4=minGQ=3(inclusive),maxGQ=4(exclusive)
##GVCFBlock30-31=minGQ=30(inclusive),maxGQ=31(exclusive)
##GVCFBlock31-32=minGQ=31(inclusive),maxGQ=32(exclusive)
##GVCFBlock32-33=minGQ=32(inclusive),maxGQ=33(exclusive)
##GVCFBlock33-34=minGQ=33(inclusive),maxGQ=34(exclusive)
##GVCFBlock34-35=minGQ=34(inclusive),maxGQ=35(exclusive)
##GVCFBlock35-36=minGQ=35(inclusive),maxGQ=36(exclusive)
##GVCFBlock36-37=minGQ=36(inclusive),maxGQ=37(exclusive)
##GVCFBlock37-38=minGQ=37(inclusive),maxGQ=38(exclusive)
##GVCFBlock38-39=minGQ=38(inclusive),maxGQ=39(exclusive)
##GVCFBlock39-40=minGQ=39(inclusive),maxGQ=40(exclusive)
##GVCFBlock4-5=minGQ=4(inclusive),maxGQ=5(exclusive)
##GVCFBlock40-41=minGQ=40(inclusive),maxGQ=41(exclusive)
##GVCFBlock41-42=minGQ=41(inclusive),maxGQ=42(exclusive)
##GVCFBlock42-43=minGQ=42(inclusive),maxGQ=43(exclusive)
##GVCFBlock43-44=minGQ=43(inclusive),maxGQ=44(exclusive)
##GVCFBlock44-45=minGQ=44(inclusive),maxGQ=45(exclusive)
##GVCFBlock45-46=minGQ=45(inclusive),maxGQ=46(exclusive)
##GVCFBlock46-47=minGQ=46(inclusive),maxGQ=47(exclusive)
##GVCFBlock47-48=minGQ=47(inclusive),maxGQ=48(exclusive)
##GVCFBlock48-49=minGQ=48(inclusive),maxGQ=49(exclusive)
##GVCFBlock49-50=minGQ=49(inclusive),maxGQ=50(exclusive)
##GVCFBlock5-6=minGQ=5(inclusive),maxGQ=6(exclusive)
##GVCFBlock50-51=minGQ=50(inclusive),maxGQ=51(exclusive)
##GVCFBlock51-52=minGQ=51(inclusive),maxGQ=52(exclusive)
##GVCFBlock52-53=minGQ=52(inclusive),maxGQ=53(exclusive)
##GVCFBlock53-54=minGQ=53(inclusive),maxGQ=54(exclusive)
##GVCFBlock54-55=minGQ=54(inclusive),maxGQ=55(exclusive)
##GVCFBlock55-56=minGQ=55(inclusive),maxGQ=56(exclusive)
##GVCFBlock56-57=minGQ=56(inclusive),maxGQ=57(exclusive)
##GVCFBlock57-58=minGQ=57(inclusive),maxGQ=58(exclusive)
##GVCFBlock58-59=minGQ=58(inclusive),maxGQ=59(exclusive)
##GVCFBlock59-60=minGQ=59(inclusive),maxGQ=60(exclusive)
##GVCFBlock6-7=minGQ=6(inclusive),maxGQ=7(exclusive)
##GVCFBlock60-70=minGQ=60(inclusive),maxGQ=70(exclusive)
##GVCFBlock7-8=minGQ=7(inclusive),maxGQ=8(exclusive)
##GVCFBlock70-80=minGQ=70(inclusive),maxGQ=80(exclusive)
##GVCFBlock8-9=minGQ=8(inclusive),maxGQ=9(exclusive)
##GVCFBlock80-90=minGQ=80(inclusive),maxGQ=90(exclusive)
##GVCFBlock9-10=minGQ=9(inclusive),maxGQ=10(exclusive)
##GVCFBlock90-99=minGQ=90(inclusive),maxGQ=99(exclusive)
##GVCFBlock99-100=minGQ=99(inclusive),maxGQ=100(exclusive)
##INFO=<ID=BaseQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt Vs. Ref base qualities">
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth; some reads may have been filtered">
##INFO=<ID=END,Number=1,Type=Integer,Description="Stop position of the interval">
##INFO=<ID=ExcessHet,Number=1,Type=Float,Description="Phred-scaled p-value for exact test of excess heterozygosity">
##INFO=<ID=InbreedingCoeff,Number=1,Type=Float,Description="Inbreeding coefficient as estimated from the genotype likelihoods per-sample when compared against the Hardy-Weinberg expectation">
##INFO=<ID=MLEAC,Number=A,Type=Integer,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele counts (not necessarily the same as the AC), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MLEAF,Number=A,Type=Float,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele frequency (not necessarily the same as the AF), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score From Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read mapping qualities">
##INFO=<ID=RAW_MQandDP,Number=2,Type=Integer,Description="Raw data (sum of squared MQ and total depth) for improved RMS Mapping Quality calculation. Incompatible with deprecated RAW_MQ formulation.">
##INFO=<ID=ReadPosRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read position bias">
##contig=<ID=20_10037292_10066351,length=29059>
##source=HaplotypeCaller
#CHROM	POS	ID	REF	ALT	QUAL	FILTER	INFO	FORMAT	reads_mother
20_10037292_10066351	3277	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3278	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:38:99:37:0,102,1530
20_10037292_10066351	3279	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3279	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:37:81:37:0,81,1084
20_10037292_10066351	3280	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3281	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:37:99:37:0,99,1485
20_10037292_10066351	3282	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3282	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:36:96:36:0,96,1440
20_10037292_10066351	3283	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3283	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:35:87:35:0,87,1305
20_10037292_10066351	3284	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3284	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:37:90:37:0,90,1350
20_10037292_10066351	3285	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3293	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:35:81:31:0,81,1215
20_10037292_10066351	3294	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3302	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:90:30:0,90,970
20_10037292_10066351	3303	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3304	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:72:32:0,72,963
20_10037292_10066351	3305	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3309	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:34:99:33:0,99,1053
20_10037292_10066351	3310	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3319	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:35:90:35:0,90,1086
20_10037292_10066351	3320	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3320	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:68:33:0,68,959
20_10037292_10066351	3321	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3322	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:84:32:0,84,1260
20_10037292_10066351	3323	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3323	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:79:32:0,79,953
20_10037292_10066351	3324	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3325	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:81:32:0,81,1215
20_10037292_10066351	3326	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3326	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:60:31:0,60,873
20_10037292_10066351	3327	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3328	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:78:30:0,78,1170
20_10037292_10066351	3329	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3329	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:81:31:0,81,1215
20_10037292_10066351	3330	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3330	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:76:31:0,76,949
20_10037292_10066351	3331	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3332	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:81:29:0,81,1215
20_10037292_10066351	3333	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3335	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:72:30:0,72,892
20_10037292_10066351	3336	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3337	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:84:30:0,84,1260
20_10037292_10066351	3338	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3338	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:59:30:0,59,851
20_10037292_10066351	3339	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3339	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:84:30:0,84,1260
20_10037292_10066351	3340	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3340	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:77:30:0,77,888
20_10037292_10066351	3341	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3343	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:84:28:0,84,910
20_10037292_10066351	3344	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3344	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:29:73:29:0,73,832
20_10037292_10066351	3345	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3348	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:29:87:29:0,87,891
20_10037292_10066351	3349	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3349	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:29:72:29:0,72,904
20_10037292_10066351	3350	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3350	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:29:87:29:0,87,910
20_10037292_10066351	3351	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3352	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:90:30:0,90,975
20_10037292_10066351	3353	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3354	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:72:30:0,72,846
20_10037292_10066351	3355	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3355	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:93:31:0,93,978
20_10037292_10066351	3356	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3357	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:67:31:0,67,916
20_10037292_10066351	3358	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3363	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:90:31:0,90,1017
20_10037292_10066351	3364	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3364	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:82:32:0,82,947
20_10037292_10066351	3365	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3365	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:90:32:0,90,1350
20_10037292_10066351	3366	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3366	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:79:32:0,79,963
20_10037292_10066351	3367	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3369	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:90:31:0,90,1350
20_10037292_10066351	3370	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3370	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:46:32:0,46,903
20_10037292_10066351	3371	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3371	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:90:32:0,90,1350
20_10037292_10066351	3372	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3372	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:80:32:0,80,905
20_10037292_10066351	3373	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3374	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:90:32:0,90,1350
20_10037292_10066351	3375	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3375	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:76:31:0,76,922
20_10037292_10066351	3376	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3376	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:93:33:0,93,1395
20_10037292_10066351	3377	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3381	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:84:31:0,84,1260
20_10037292_10066351	3382	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3385	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:90:33:0,90,1350
20_10037292_10066351	3386	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3387	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:34:84:33:0,84,964
20_10037292_10066351	3388	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3397	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:90:31:0,90,1350
20_10037292_10066351	3398	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3398	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:75:31:0,75,920
20_10037292_10066351	3399	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3399	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:87:31:0,87,1305
20_10037292_10066351	3400	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3400	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:90:32:0,90,1350
20_10037292_10066351	3401	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3402	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:87:31:0,87,1305
20_10037292_10066351	3403	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3403	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:90:32:0,90,1350
20_10037292_10066351	3404	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3405	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:80:32:0,80,944
20_10037292_10066351	3406	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3407	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:72:30:0,72,859
20_10037292_10066351	3408	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3408	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:62:32:0,62,890
20_10037292_10066351	3409	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3418	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:81:30:0,81,1215
20_10037292_10066351	3419	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3419	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:29:74:29:0,74,827
20_10037292_10066351	3420	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3421	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:84:29:0,84,1260
20_10037292_10066351	3422	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3430	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:29:75:28:0,75,1125
20_10037292_10066351	3431	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3439	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:28:81:28:0,81,1215
20_10037292_10066351	3440	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3440	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:28:70:28:0,70,782
20_10037292_10066351	3441	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3442	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:28:81:28:0,81,1215
20_10037292_10066351	3443	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3443	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:28:78:28:0,78,1170
20_10037292_10066351	3444	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3445	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:28:64:28:0,64,722
20_10037292_10066351	3446	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3446	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:28:78:28:0,78,1170
20_10037292_10066351	3447	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3447	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:29:53:29:0,53,694
20_10037292_10066351	3448	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3449	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:76:30:0,76,827
20_10037292_10066351	3450	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3450	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:87:31:0,87,1305
20_10037292_10066351	3451	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3452	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:74:31:0,74,715
20_10037292_10066351	3453	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3455	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:84:31:0,84,1260
20_10037292_10066351	3456	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3456	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:23:31:0,23,766
20_10037292_10066351	3457	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3460	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:90:31:0,90,1350
20_10037292_10066351	3461	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3461	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:30:89:30:0,89,873
20_10037292_10066351	3462	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3462	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:90:31:0,90,1350
20_10037292_10066351	3463	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3463	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:44:31:0,44,739
20_10037292_10066351	3464	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3468	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:90:32:0,90,1350
20_10037292_10066351	3469	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3469	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:79:32:0,79,816
20_10037292_10066351	3470	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3470	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:31:84:31:0,84,1260
20_10037292_10066351	3471	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3478	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:75:32:0,75,1125
20_10037292_10066351	3479	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3479	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:34:36:34:0,36,906
20_10037292_10066351	3480	.	C	CT,<NON_REF>	503.03	.	DP=23;ExcessHet=0.0000;MLEAC=2,0;MLEAF=1.00,0.00;RAW_MQandDP=82800,23	GT:AD:DP:GQ:PL:SB	1/1:0,18,0:18:54:517,54,0,517,54,517:0,0,7,11
20_10037292_10066351	3481	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3481	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:21:51:21:0,51,765
20_10037292_10066351	3482	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3482	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:21:54:21:0,54,810
20_10037292_10066351	3483	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3487	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:20:51:19:0,51,765
20_10037292_10066351	3488	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3488	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:42:19:0,42,571
20_10037292_10066351	3489	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3489	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:17:51:17:0,51,521
20_10037292_10066351	3490	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3490	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:17:35:17:0,35,431
20_10037292_10066351	3491	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3495	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:17:48:17:0,48,720
20_10037292_10066351	3496	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3498	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:17:51:17:0,51,473
20_10037292_10066351	3499	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3499	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:16:48:16:0,48,428
20_10037292_10066351	3500	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3500	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:16:31:16:0,31,379
20_10037292_10066351	3501	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3501	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:17:48:17:0,48,720
20_10037292_10066351	3502	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3503	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:54:18:0,54,550
20_10037292_10066351	3504	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3504	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:48:19:0,48,720
20_10037292_10066351	3505	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3506	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:20:51:20:0,51,765
20_10037292_10066351	3507	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3519	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:54:18:0,54,501
20_10037292_10066351	3520	.	AT	A,<NON_REF>	609.03	.	DP=18;ExcessHet=0.0000;MLEAC=2,0;MLEAF=1.00,0.00;RAW_MQandDP=64800,18	GT:AD:DP:GQ:PL:SB	1/1:0,18,0:18:54:623,54,0,623,54,623:0,0,9,9
20_10037292_10066351	3522	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3525	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:18:54:18:0,54,550
20_10037292_10066351	3526	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3527	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:57:19:0,57,607
20_10037292_10066351	3528	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3528	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:54:19:0,54,810
20_10037292_10066351	3529	.	T	A,<NON_REF>	155.64	.	BaseQRankSum=-0.544;DP=21;ExcessHet=0.0000;MLEAC=1,0;MLEAF=0.500,0.00;MQRankSum=0.000;RAW_MQandDP=75600,21;ReadPosRankSum=-1.158	GT:AD:DP:GQ:PL:SB	0/1:12,8,0:20:99:163,0,328,199,352,551:5,7,5,3
20_10037292_10066351	3530	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3530	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:64:33:0,64,941
20_10037292_10066351	3531	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3533	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:81:33:0,81,1215
20_10037292_10066351	3534	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3534	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:78:33:0,78,1170
20_10037292_10066351	3535	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3536	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:68:33:0,68,891
20_10037292_10066351	3537	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3546	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:29:72:26:0,72,1080

Son başlık satırını ve dosyadaki ilk üç 'gerçek' varyant çağrısını bir kez daha vurguladık.

Varyant çağrı satırlarının, varyant çağırıcının varyasyon kanıtı bulmadığı varyant olmayan bölgeleri temsil eden pek çok varyant dışı satırla iç içe geçtiğini fark edeceksiniz. Yukarıda kısaca belirtildiği gibi, GVCF modunun varyant çağırmayı özel kılan özelliği budur: varyant çağırıcı, varyasyon yokluğuna ilişkin güven düzeyini tanımlayan bazı istatistikleri kaydeder. Bu sayede iki çok farklı durum arasında ayrım yapmak mümkün olur: (1) örneğin homozigot-referans olduğunu gösteren kaliteli veriler mevcuttur ve (2) herhangi bir yönde karar vermek için yeterli kaliteli veri bulunmamaktadır.

Bunun gibi bir GVCF'de genellikle çok sayıda varyant dışı satır bulunur; bunların arasına daha az sayıda varyant kaydı serpiştirilmiştir.

2.2.3. İşlemi Diğer İki Örnek İçin Tekrarlama

Şimdi aşağıdaki komutları birbiri ardına çalıştırarak kalan iki örnek için GVCF'leri oluşturalım.

gatk HaplotypeCaller \
        -R /data/ref/ref.fasta \
        -I /data/bam/reads_father.bam \
        -O reads_father.g.vcf \
        -L /data/ref/intervals.bed \
        -ERC GVCF

Komut çıktısı

Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar HaplotypeCaller -R /data/ref/ref.fasta -I /data/bam/reads_father.bam -O reads_father.g.vcf -L /data/ref/intervals.bed -ERC GVCF
17:28:30.677 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
17:28:30.801 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:28:30.803 INFO  HaplotypeCaller - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - Executing as root@be1a0302f6c7 on Linux v6.8.0-1030-azure amd64
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - Start Date/Time: February 11, 2026 at 5:28:30 PM GMT
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:28:30.805 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Version: 4.1.0
17:28:30.805 INFO  HaplotypeCaller - Picard Version: 3.1.1
17:28:30.805 INFO  HaplotypeCaller - Built for Spark Version: 3.5.0
17:28:30.806 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
17:28:30.806 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
17:28:30.806 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
17:28:30.806 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
17:28:30.806 INFO  HaplotypeCaller - Deflater: IntelDeflater
17:28:30.807 INFO  HaplotypeCaller - Inflater: IntelInflater
17:28:30.807 INFO  HaplotypeCaller - GCS max retries/reopens: 20
17:28:30.807 INFO  HaplotypeCaller - Requester pays: disabled
17:28:30.807 INFO  HaplotypeCaller - Initializing engine
17:28:30.933 INFO  FeatureManager - Using codec BEDCodec to read file file:///data/ref/intervals.bed
17:28:30.946 INFO  IntervalArgumentCollection - Processing 6369 bp from intervals
17:28:30.951 INFO  HaplotypeCaller - Done initializing engine
17:28:30.953 INFO  HaplotypeCallerEngine - Tool is in reference confidence mode and the annotation, the following changes will be made to any specified annotations: 'StrandBiasBySample' will be enabled. 'ChromosomeCounts', 'FisherStrand', 'StrandOddsRatio' and 'QualByDepth' annotations have been disabled
17:28:30.957 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_utils.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_utils.so
17:28:30.959 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_smithwaterman.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_smithwaterman.so
17:28:30.960 INFO  SmithWatermanAligner - Using AVX accelerated SmithWaterman implementation
17:28:30.963 INFO  HaplotypeCallerEngine - Standard Emitting and Calling confidence set to -0.0 for reference-model confidence output
17:28:30.963 INFO  HaplotypeCallerEngine - All sites annotated with PLs forced to true for reference-model confidence output
17:28:30.972 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_pairhmm_omp.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_pairhmm_omp.so
17:28:30.987 INFO  IntelPairHmm - Flush-to-zero (FTZ) is enabled when running PairHMM
17:28:30.987 INFO  IntelPairHmm - Available threads: 4
17:28:30.987 INFO  IntelPairHmm - Requested threads: 4
17:28:30.987 INFO  PairHMM - Using the OpenMP multi-threaded AVX-accelerated native PairHMM implementation
17:28:31.034 INFO  ProgressMeter - Starting traversal
17:28:31.034 INFO  ProgressMeter -        Current Locus  Elapsed Minutes     Regions Processed   Regions/Minute
17:28:31.570 WARN  InbreedingCoeff - InbreedingCoeff will not be calculated at position 20_10037292_10066351:3480 and possibly subsequent; at least 10 samples must have called genotypes
17:28:32.865 INFO  HaplotypeCaller - 9 read(s) filtered by: MappingQualityReadFilter
0 read(s) filtered by: MappingQualityAvailableReadFilter
0 read(s) filtered by: MappedReadFilter
0 read(s) filtered by: NotSecondaryAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: NotDuplicateReadFilter
0 read(s) filtered by: PassesVendorQualityCheckReadFilter
0 read(s) filtered by: NonZeroReferenceLengthAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: GoodCigarReadFilter
0 read(s) filtered by: WellformedReadFilter
9 total reads filtered out of 2064 reads processed
17:28:32.866 INFO  ProgressMeter - 20_10037292_10066351:13338              0.0                    38           1245.2
17:28:32.866 INFO  ProgressMeter - Traversal complete. Processed 38 total regions in 0.0 minutes.
17:28:32.868 INFO  VectorLoglessPairHMM - Time spent in setup for JNI call : 0.0035923200000000004
17:28:32.868 INFO  PairHMM - Total compute time in PairHMM computeLogLikelihoods() : 0.10765202500000001
17:28:32.868 INFO  SmithWatermanAligner - Total compute time in native Smith-Waterman : 0.03 sec
17:28:32.869 INFO  HaplotypeCaller - Shutting down engine
[February 11, 2026 at 5:28:32 PM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.walkers.haplotypecaller.HaplotypeCaller done. Elapsed time: 0.04 minutes.
Runtime.totalMemory()=299892736

gatk HaplotypeCaller \
        -R /data/ref/ref.fasta \
        -I /data/bam/reads_son.bam \
        -O reads_son.g.vcf \
        -L /data/ref/intervals.bed \
        -ERC GVCF

Komut çıktısı

Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar HaplotypeCaller -R /data/ref/ref.fasta -I /data/bam/reads_son.bam -O reads_son.g.vcf -L /data/ref/intervals.bed -ERC GVCF
17:30:10.017 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
17:30:10.156 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - Executing as root@be1a0302f6c7 on Linux v6.8.0-1030-azure amd64
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - Start Date/Time: February 11, 2026 at 5:30:09 PM GMT
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:30:10.160 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:30:10.160 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Version: 4.1.0
17:30:10.160 INFO  HaplotypeCaller - Picard Version: 3.1.1
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - Built for Spark Version: 3.5.0
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - Deflater: IntelDeflater
17:30:10.162 INFO  HaplotypeCaller - Inflater: IntelInflater
17:30:10.162 INFO  HaplotypeCaller - GCS max retries/reopens: 20
17:30:10.162 INFO  HaplotypeCaller - Requester pays: disabled
17:30:10.162 INFO  HaplotypeCaller - Initializing engine
17:30:10.277 INFO  FeatureManager - Using codec BEDCodec to read file file:///data/ref/intervals.bed
17:30:10.290 INFO  IntervalArgumentCollection - Processing 6369 bp from intervals
17:30:10.296 INFO  HaplotypeCaller - Done initializing engine
17:30:10.298 INFO  HaplotypeCallerEngine - Tool is in reference confidence mode and the annotation, the following changes will be made to any specified annotations: 'StrandBiasBySample' will be enabled. 'ChromosomeCounts', 'FisherStrand', 'StrandOddsRatio' and 'QualByDepth' annotations have been disabled
17:30:10.302 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_utils.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_utils.so
17:30:10.303 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_smithwaterman.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_smithwaterman.so
17:30:10.304 INFO  SmithWatermanAligner - Using AVX accelerated SmithWaterman implementation
17:30:10.307 INFO  HaplotypeCallerEngine - Standard Emitting and Calling confidence set to -0.0 for reference-model confidence output
17:30:10.307 INFO  HaplotypeCallerEngine - All sites annotated with PLs forced to true for reference-model confidence output
17:30:10.315 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_pairhmm_omp.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_pairhmm_omp.so
17:30:10.328 INFO  IntelPairHmm - Flush-to-zero (FTZ) is enabled when running PairHMM
17:30:10.329 INFO  IntelPairHmm - Available threads: 4
17:30:10.329 INFO  IntelPairHmm - Requested threads: 4
17:30:10.329 INFO  PairHMM - Using the OpenMP multi-threaded AVX-accelerated native PairHMM implementation
17:30:10.368 INFO  ProgressMeter - Starting traversal
17:30:10.369 INFO  ProgressMeter -        Current Locus  Elapsed Minutes     Regions Processed   Regions/Minute
17:30:10.875 WARN  InbreedingCoeff - InbreedingCoeff will not be calculated at position 20_10037292_10066351:3480 and possibly subsequent; at least 10 samples must have called genotypes
17:30:11.980 INFO  HaplotypeCaller - 14 read(s) filtered by: MappingQualityReadFilter
0 read(s) filtered by: MappingQualityAvailableReadFilter
0 read(s) filtered by: MappedReadFilter
0 read(s) filtered by: NotSecondaryAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: NotDuplicateReadFilter
0 read(s) filtered by: PassesVendorQualityCheckReadFilter
0 read(s) filtered by: NonZeroReferenceLengthAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: GoodCigarReadFilter
0 read(s) filtered by: WellformedReadFilter
14 total reads filtered out of 1981 reads processed
17:30:11.981 INFO  ProgressMeter - 20_10037292_10066351:13223              0.0                    35           1302.7
17:30:11.981 INFO  ProgressMeter - Traversal complete. Processed 35 total regions in 0.0 minutes.
17:30:11.983 INFO  VectorLoglessPairHMM - Time spent in setup for JNI call : 0.0034843710000000004
17:30:11.983 INFO  PairHMM - Total compute time in PairHMM computeLogLikelihoods() : 0.048108363
17:30:11.983 INFO  SmithWatermanAligner - Total compute time in native Smith-Waterman : 0.02 sec
17:30:11.984 INFO  HaplotypeCaller - Shutting down engine
[February 11, 2026 at 5:30:11 PM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.walkers.haplotypecaller.HaplotypeCaller done. Elapsed time: 0.03 minutes.
Runtime.totalMemory()=226492416

Bu işlem tamamlandığında, geçerli dizininizde .g.vcf ile biten üç dosya (her örnek için bir tane) ve .g.vcf.idx ile biten ilgili indeks dosyaları bulunmalıdır.

Dizin içeriği

conda.yml        reads_father.g.vcf      reads_mother.g.vcf      reads_son.g.vcf
hsperfdata_root  reads_father.g.vcf.idx  reads_mother.g.vcf.idx  reads_son.g.vcf.idx

Bu noktada, girdi örneklerimizin her biri için GVCF modunda varyant çağrısı yaptık. Artık ortak çağırmaya geçme zamanı.

Ancak konteynerden çıkmayın! Bir sonraki adımda aynı konteyneri kullanacağız.

2.3. Ortak Genotiplemeyi Çalıştırma

Artık tüm GVCF'lere sahip olduğumuza göre, bir örnek kohortu için varyant çağrıları üretmek amacıyla ortak genotipleme yaklaşımını deneyebiliriz. Bu iki adımlı bir yöntemdir: tüm GVCF'lerin verilerini bir veri deposunda birleştirmek, ardından ortak çağrılan varyantların nihai VCF'ini oluşturmak için ortak genotipleme analizini çalıştırmak.

2.3.1. Örnek Başına Tüm GVCF'leri Birleştirme

Bu ilk adım, tüm GVCF'lerin verilerini bir GenomicsDB veri deposunda birleştirmek için GenomicsDBImport adlı başka bir GATK aracını kullanır. GenomicsDB veri deposu, varyant bilgileri için ara depolama görevi gören bir tür veritabanı formatıdır.

gatk GenomicsDBImport \
    -V reads_mother.g.vcf \
    -V reads_father.g.vcf \
    -V reads_son.g.vcf \
    -L /data/ref/intervals.bed \
    --genomicsdb-workspace-path family_trio_gdb

Komut çıktısı

Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar GenomicsDBImport -V reads_mother.g.vcf -V reads_father.g.vcf -V reads_son.g.vcf -L /data/ref/intervals.bed --genomicsdb-workspace-path family_trio_gdb
17:37:07.569 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
17:37:07.699 INFO  GenomicsDBImport - ------------------------------------------------------------
17:37:07.702 INFO  GenomicsDBImport - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
17:37:07.702 INFO  GenomicsDBImport - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
17:37:07.703 INFO  GenomicsDBImport - Executing as root@be1a0302f6c7 on Linux v6.8.0-1030-azure amd64
17:37:07.703 INFO  GenomicsDBImport - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
17:37:07.704 INFO  GenomicsDBImport - Start Date/Time: February 11, 2026 at 5:37:07 PM GMT
17:37:07.704 INFO  GenomicsDBImport - ------------------------------------------------------------
17:37:07.704 INFO  GenomicsDBImport - ------------------------------------------------------------
17:37:07.706 INFO  GenomicsDBImport - HTSJDK Version: 4.1.0
17:37:07.706 INFO  GenomicsDBImport - Picard Version: 3.1.1
17:37:07.707 INFO  GenomicsDBImport - Built for Spark Version: 3.5.0
17:37:07.709 INFO  GenomicsDBImport - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
17:37:07.709 INFO  GenomicsDBImport - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
17:37:07.709 INFO  GenomicsDBImport - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
17:37:07.710 INFO  GenomicsDBImport - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
17:37:07.710 INFO  GenomicsDBImport - Deflater: IntelDeflater
17:37:07.711 INFO  GenomicsDBImport - Inflater: IntelInflater
17:37:07.711 INFO  GenomicsDBImport - GCS max retries/reopens: 20
17:37:07.711 INFO  GenomicsDBImport - Requester pays: disabled
17:37:07.712 INFO  GenomicsDBImport - Initializing engine
17:37:07.883 INFO  FeatureManager - Using codec BEDCodec to read file file:///data/ref/intervals.bed
17:37:07.886 INFO  IntervalArgumentCollection - Processing 6369 bp from intervals
17:37:07.889 INFO  GenomicsDBImport - Done initializing engine
17:37:08.560 INFO  GenomicsDBLibLoader - GenomicsDB native library version : 1.5.1-84e800e
17:37:08.561 INFO  GenomicsDBImport - Vid Map JSON file will be written to /tmp/family_trio_gdb/vidmap.json
17:37:08.561 INFO  GenomicsDBImport - Callset Map JSON file will be written to /tmp/family_trio_gdb/callset.json
17:37:08.561 INFO  GenomicsDBImport - Complete VCF Header will be written to /tmp/family_trio_gdb/vcfheader.vcf
17:37:08.561 INFO  GenomicsDBImport - Importing to workspace - /tmp/family_trio_gdb
17:37:08.878 INFO  GenomicsDBImport - Importing batch 1 with 3 samples
17:37:09.359 INFO  GenomicsDBImport - Importing batch 1 with 3 samples
17:37:09.487 INFO  GenomicsDBImport - Importing batch 1 with 3 samples
17:37:09.591 INFO  GenomicsDBImport - Done importing batch 1/1
17:37:09.592 INFO  GenomicsDBImport - Import completed!
17:37:09.592 INFO  GenomicsDBImport - Shutting down engine
[February 11, 2026 at 5:37:09 PM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.genomicsdb.GenomicsDBImport done. Elapsed time: 0.03 minutes.
Runtime.totalMemory()=113246208
Tool returned:
true

Bu adımın çıktısı, birleştirilmiş varyant verilerini çeşitli farklı dosyalar biçiminde tutan iç içe geçmiş dizinler içeren bir dizinden oluşur. İçeriği inceleyebilirsiniz; ancak bu veri deposu formatının doğrudan insanlar tarafından okunması için tasarlanmadığını hemen göreceksiniz.

İpucu

GATK, gerektiğinde veri deposundan varyant çağrısı verilerini incelemeyi ve çıkarmayı mümkün kılan araçlar içerir.

2.3.2. Ortak Genotipleme Analizini Çalıştırma

Bu ikinci adım, kohortdaki tüm örneklerde mevcut verileri göz önünde bulundurarak varyant istatistiklerini ve bireysel genotipleri yeniden hesaplamak için GenotypeGVCFs adlı başka bir GATK aracını kullanır.

gatk GenotypeGVCFs \
    -R /data/ref/ref.fasta \
    -V gendb://family_trio_gdb \
    -O family_trio.vcf

Komut çıktısı

Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar GenotypeGVCFs -R /data/ref/ref.fasta -V gendb://family_trio_gdb -O family_trio.vcf
17:38:45.084 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
17:38:45.217 INFO  GenotypeGVCFs - ------------------------------------------------------------
17:38:45.220 INFO  GenotypeGVCFs - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
17:38:45.220 INFO  GenotypeGVCFs - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
17:38:45.220 INFO  GenotypeGVCFs - Executing as root@be1a0302f6c7 on Linux v6.8.0-1030-azure amd64
17:38:45.220 INFO  GenotypeGVCFs - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
17:38:45.221 INFO  GenotypeGVCFs - Start Date/Time: February 11, 2026 at 5:38:45 PM GMT
17:38:45.221 INFO  GenotypeGVCFs - ------------------------------------------------------------
17:38:45.221 INFO  GenotypeGVCFs - ------------------------------------------------------------
17:38:45.221 INFO  GenotypeGVCFs - HTSJDK Version: 4.1.0
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - Picard Version: 3.1.1
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - Built for Spark Version: 3.5.0
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
17:38:45.223 INFO  GenotypeGVCFs - Deflater: IntelDeflater
17:38:45.223 INFO  GenotypeGVCFs - Inflater: IntelInflater
17:38:45.223 INFO  GenotypeGVCFs - GCS max retries/reopens: 20
17:38:45.223 INFO  GenotypeGVCFs - Requester pays: disabled
17:38:45.223 INFO  GenotypeGVCFs - Initializing engine
17:38:45.544 INFO  GenomicsDBLibLoader - GenomicsDB native library version : 1.5.1-84e800e
17:38:45.561 INFO  NativeGenomicsDB - pid=221 tid=222 No valid combination operation found for INFO field InbreedingCoeff  - the field will NOT be part of INFO fields in the generated VCF records
17:38:45.561 INFO  NativeGenomicsDB - pid=221 tid=222 No valid combination operation found for INFO field MLEAC  - the field will NOT be part of INFO fields in the generated VCF records
17:38:45.561 INFO  NativeGenomicsDB - pid=221 tid=222 No valid combination operation found for INFO field MLEAF  - the field will NOT be part of INFO fields in the generated VCF records
17:38:45.577 INFO  GenotypeGVCFs - Done initializing engine
17:38:45.615 INFO  ProgressMeter - Starting traversal
17:38:45.615 INFO  ProgressMeter -        Current Locus  Elapsed Minutes    Variants Processed  Variants/Minute
17:38:45.903 WARN  InbreedingCoeff - InbreedingCoeff will not be calculated at position 20_10037292_10066351:3480 and possibly subsequent; at least 10 samples must have called genotypes
GENOMICSDB_TIMER,GenomicsDB iterator next() timer,Wall-clock time(s),0.07757032800000006,Cpu time(s),0.07253379200000037
17:38:46.421 INFO  ProgressMeter - 20_10037292_10066351:13953              0.0                  3390         252357.3
17:38:46.422 INFO  ProgressMeter - Traversal complete. Processed 3390 total variants in 0.0 minutes.
17:38:46.423 INFO  GenotypeGVCFs - Shutting down engine
[February 11, 2026 at 5:38:46 PM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.walkers.GenotypeGVCFs done. Elapsed time: 0.02 minutes.
Runtime.totalMemory()=203423744

Bu işlem, konteynerdeki geçerli çalışma dizininde family_trio.vcf VCF çıktı dosyasını ve indeksi olan family_trio.vcf.idx'i oluşturur. Bu da makul ölçüde küçük bir dosyadır; dolayısıyla dosya içeriğini görüntülemek için cat family_trio.vcf komutunu çalıştırabilir ve ilk birkaç varyant satırını bulmak için aşağı kaydırabilirsiniz.

Dosya içeriği (kısaltılmış)

##fileformat=VCFv4.2
##ALT=<ID=NON_REF,Description="Represents any possible alternative allele not already represented at this location by REF and ALT">
##FILTER=<ID=LowQual,Description="Low quality">
##FILTER=<ID=PASS,Description="All filters passed">
##FORMAT=<ID=AD,Number=R,Type=Integer,Description="Allelic depths for the ref and alt alleles in the order listed">
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth (reads with MQ=255 or with bad mates are filtered)">
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">
##FORMAT=<ID=MIN_DP,Number=1,Type=Integer,Description="Minimum DP observed within the GVCF block">
##FORMAT=<ID=PGT,Number=1,Type=String,Description="Physical phasing haplotype information, describing how the alternate alleles are phased in relation to one another; will always be heterozygous and is not intended to describe called alleles">
##FORMAT=<ID=PID,Number=1,Type=String,Description="Physical phasing ID information, where each unique ID within a given sample (but not across samples) connects records within a phasing group">
##FORMAT=<ID=PL,Number=G,Type=Integer,Description="Normalized, Phred-scaled likelihoods for genotypes as defined in the VCF specification">
##FORMAT=<ID=PS,Number=1,Type=Integer,Description="Phasing set (typically the position of the first variant in the set)">
##FORMAT=<ID=RGQ,Number=1,Type=Integer,Description="Unconditional reference genotype confidence, encoded as a phred quality -10*log10 p(genotype call is wrong)">
##FORMAT=<ID=SB,Number=4,Type=Integer,Description="Per-sample component statistics which comprise the Fisher's Exact Test to detect strand bias.">
##GATKCommandLine=<ID=GenomicsDBImport,CommandLine="GenomicsDBImport --genomicsdb-workspace-path family_trio_gdb --variant reads_mother.g.vcf --variant reads_father.g.vcf --variant reads_son.g.vcf --intervals /data/ref/intervals.bed [abridged]",Version="4.5.0.0",Date="February 11, 2026 at 5:37:07 PM GMT">
##GATKCommandLine=<ID=GenotypeGVCFs,CommandLine="GenotypeGVCFs --output family_trio.vcf --variant gendb://family_trio_gdb --reference /data/ref/ref.fasta --include-non-variant-sites false [abridged]",Version="4.5.0.0",Date="February 11, 2026 at 5:38:45 PM GMT">
##GATKCommandLine=<ID=HaplotypeCaller,CommandLine="HaplotypeCaller --emit-ref-confidence GVCF --output reads_mother.g.vcf --intervals /data/ref/intervals.bed --input /data/bam/reads_mother.bam --reference /data/ref/ref.fasta [abridged]",Version="4.5.0.0",Date="February 11, 2026 at 4:51:00 PM GMT">
##INFO=<ID=AC,Number=A,Type=Integer,Description="Allele count in genotypes, for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=AF,Number=A,Type=Float,Description="Allele Frequency, for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=AN,Number=1,Type=Integer,Description="Total number of alleles in called genotypes">
##INFO=<ID=BaseQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt Vs. Ref base qualities">
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth; some reads may have been filtered">
##INFO=<ID=END,Number=1,Type=Integer,Description="Stop position of the interval">
##INFO=<ID=ExcessHet,Number=1,Type=Float,Description="Phred-scaled p-value for exact test of excess heterozygosity">
##INFO=<ID=FS,Number=1,Type=Float,Description="Phred-scaled p-value using Fisher's exact test to detect strand bias">
##INFO=<ID=InbreedingCoeff,Number=1,Type=Float,Description="Inbreeding coefficient as estimated from the genotype likelihoods per-sample when compared against the Hardy-Weinberg expectation">
##INFO=<ID=MLEAC,Number=A,Type=Integer,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele counts (not necessarily the same as the AC), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MLEAF,Number=A,Type=Float,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele frequency (not necessarily the same as the AF), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MQ,Number=1,Type=Float,Description="RMS Mapping Quality">
##INFO=<ID=MQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score From Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read mapping qualities">
##INFO=<ID=QD,Number=1,Type=Float,Description="Variant Confidence/Quality by Depth">
##INFO=<ID=RAW_MQandDP,Number=2,Type=Integer,Description="Raw data (sum of squared MQ and total depth) for improved RMS Mapping Quality calculation. Incompatible with deprecated RAW_MQ formulation.">
##INFO=<ID=ReadPosRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read position bias">
##INFO=<ID=SOR,Number=1,Type=Float,Description="Symmetric Odds Ratio of 2x2 contingency table to detect strand bias">
##contig=<ID=20_10037292_10066351,length=29059>
##source=GenomicsDBImport
##source=GenotypeGVCFs
##source=HaplotypeCaller
#CHROM  POS     ID      REF     ALT     QUAL    FILTER  INFO    FORMAT  reads_father    reads_mother    reads_son
20_10037292_10066351    3480    .       C       CT      1625.89 .       AC=5;AF=0.833;AN=6;BaseQRankSum=0.220;DP=85;ExcessHet=0.0000;FS=2.476;MLEAC=5;MLEAF=0.833;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=21.68;ReadPosRankSum=-1.147e+00;SOR=0.487    GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:15,16:31:99:367,0,375       1/1:0,18:18:54:517,54,0 1/1:0,26:26:78:756,78,0
20_10037292_10066351    3520    .       AT      A       1678.89 .       AC=5;AF=0.833;AN=6;BaseQRankSum=1.03;DP=80;ExcessHet=0.0000;FS=2.290;MLEAC=5;MLEAF=0.833;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=22.39;ReadPosRankSum=0.701;SOR=0.730  GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:18,13:31:99:296,0,424       1/1:0,18:18:54:623,54,0 1/1:0,26:26:78:774,78,0
20_10037292_10066351    3529    .       T       A       154.29  .       AC=1;AF=0.167;AN=6;BaseQRankSum=-5.440e-01;DP=104;ExcessHet=0.0000;FS=1.871;MLEAC=1;MLEAF=0.167;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=7.71;ReadPosRankSum=-1.158e+00;SOR=1.034       GT:AD:DP:GQ:PL  0/0:44,0:44:99:0,112,1347       0/1:12,8:20:99:163,0,328        0/0:39,0:39:99:0,105,1194
20_10037292_10066351    4012    .       C       T       3950.73 .       AC=6;AF=1.00;AN=6;DP=127;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=6;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=31.86;SOR=0.725    GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,46:46:99:1446,137,0   1/1:0,43:43:99:1412,129,0        1/1:0,35:35:99:1106,105,0
20_10037292_10066351    4409    .       A       ATATG   2478.69 .       AC=6;AF=1.00;AN=6;DP=96;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=6;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=33.95;SOR=0.963     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,28:28:90:969,90,0 1/1:0,21:21:69:724,69,0      1/1:0,24:24:72:799,72,0
20_10037292_10066351    4464    .       T       TA      620.25  .       AC=1;AF=0.167;AN=6;BaseQRankSum=0.108;DP=102;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=1;MLEAF=0.167;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=19.38;ReadPosRankSum=1.27;SOR=0.892 GT:AD:DP:GQ:PGT:PID:PL:PS       0|1:15,17:32:99:0|1:4464_T_TA:629,0,554:4464    0/0:30,0:30:78:.:.:0,78,1170 0/0:39,0:39:99:.:.:0,108,1286
20_10037292_10066351    4465    .       T       TA      620.25  .       AC=1;AF=0.167;AN=6;BaseQRankSum=-2.250e-01;DP=101;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=1;MLEAF=0.167;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=19.38;ReadPosRankSum=0.910;SOR=0.892   GT:AD:DP:GQ:PGT:PID:PL:PS       0|1:15,17:32:99:0|1:4464_T_TA:629,0,554:4464    0/0:30,0:30:78:.:.:0,78,1170 0/0:39,0:39:99:.:.:0,108,1286
20_10037292_10066351    5027    .       C       T       3339.73 .       AC=6;AF=1.00;AN=6;DP=108;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=6;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=31.51;SOR=0.731    GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,36:36:99:1164,108,0   1/1:0,26:26:77:798,77,0  1/1:0,44:44:99:1391,132,0
20_10037292_10066351    5469    .       A       G       2725.93 .       AC=5;AF=0.833;AN=6;BaseQRankSum=-3.665e+00;DP=113;ExcessHet=0.0000;FS=6.914;MLEAC=5;MLEAF=0.833;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=24.34;ReadPosRankSum=1.50;SOR=0.320    GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:18,23:41:99:553,0,486       1/1:0,42:42:99:1311,126,0       1/1:0,29:29:86:876,86,0
20_10037292_10066351    7557    .       A       G       2257.93 .       AC=5;AF=0.833;AN=6;BaseQRankSum=-1.362e+00;DP=111;ExcessHet=0.0000;FS=3.400;MLEAC=5;MLEAF=0.833;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=21.50;ReadPosRankSum=1.11;SOR=0.566    GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:19,15:34:99:313,0,493       1/1:0,34:34:99:949,100,0        1/1:0,37:37:99:1010,108,0
20_10037292_10066351    7786    .       G       T       3503.73 .       AC=6;AF=1.00;AN=6;DP=114;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=6;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=31.28;SOR=0.970    GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,34:34:99:1066,102,0   1/1:0,34:34:99:1057,102,0        1/1:0,44:44:99:1394,132,0
20_10037292_10066351    8350    .       G       C       2663.93 .       AC=5;AF=0.833;AN=6;BaseQRankSum=-1.608e+00;DP=106;ExcessHet=0.0000;FS=5.378;MLEAC=5;MLEAF=0.833;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=25.37;ReadPosRankSum=-1.870e-01;SOR=0.950      GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:16,14:30:99:356,0,430       1/1:0,39:39:99:1176,115,0       1/1:0,36:36:99:1146,108,0
20_10037292_10066351    8886    .       AAGAAAGAAAG     A       3037.69 .       AC=6;AF=1.00;AN=6;DP=89;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=6;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=25.36;SOR=2.269     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,18:18:55:804,55,0      1/1:0,29:29:88:1282,88,0        1/1:0,22:22:67:965,67,0
20_10037292_10066351    9536    .       T       C       1089.95 .       AC=3;AF=0.500;AN=6;BaseQRankSum=-5.640e-01;DP=82;ExcessHet=0.0000;FS=12.258;MLEAC=3;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=20.57;ReadPosRankSum=0.860;SOR=0.373   GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,32:32:95:950,95,0 0/0:29,0:29:81:0,81,1215        0/1:14,7:21:99:156,0,353
20_10037292_10066351    13375   .       C       T       724.29  .       AC=1;AF=0.167;AN=6;BaseQRankSum=0.171;DP=121;ExcessHet=0.0000;FS=7.398;MLEAC=1;MLEAF=0.167;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=12.71;ReadPosRankSum=0.415;SOR=1.688        GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:28,29:57:99:733,0,679       0/0:29,0:29:81:0,81,1215        0/0:34,0:34:99:0,99,1485
20_10037292_10066351    13536   .       T       C       1025.16 .       AC=2;AF=0.333;AN=6;BaseQRankSum=1.63;DP=118;ExcessHet=0.9691;FS=1.719;MLEAC=2;MLEAF=0.333;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=11.65;ReadPosRankSum=-2.000e-01;SOR=0.904    GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:21,23:44:99:591,0,526       0/1:26,18:44:99:445,0,672       0/0:29,0:29:84:0,84,1260
20_10037292_10066351    14156   .       T       C       438.16  .       AC=2;AF=0.333;AN=6;BaseQRankSum=3.20;DP=96;ExcessHet=0.9691;FS=2.381;MLEAC=2;MLEAF=0.333;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=7.82;ReadPosRankSum=1.13;SOR=0.592    GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:25,11:36:99:258,0,676       0/1:12,8:20:99:191,0,319        0/0:38,0:38:99:0,99,1117
20_10037292_10066351    14403   .       G       A       144.29  .       AC=1;AF=0.167;AN=6;BaseQRankSum=2.63;DP=116;ExcessHet=0.0000;FS=1.435;MLEAC=1;MLEAF=0.167;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=3.52;ReadPosRankSum=0.252;SOR=0.802  GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:32,9:41:99:153,0,821        0/0:37,0:37:99:0,109,1169       0/0:37,0:37:99:0,99,1113

Varyant çağrısı verilerinin başlangıcını işaretleyen son başlık satırını bir kez daha vurguladık.

Bu, daha önce oluşturduğumuz VCF'e benzer görünür; ancak bu sefer üç örneğin tamamı için genotip düzeyinde bilgiye sahibiz. Dosyadaki son üç sütun, vurgulanan başlık satırında gösterildiği gibi ID alanlarının alfabetik sırasına göre listelenen örneklerin genotip bloklarıdır.

Test aile üçlümüz için çağrılan genotiplere ilk varyant açısından bakarsak, babanın heterozigot-varyant (0/1), anne ve oğulun ise her ikisinin de homozigot-varyant (1/1) olduğunu görürüz.

Veri setinden çıkarmak istediğimiz bilgi türü nihayetinde budur!

2.3.3. Çıktı Dosyalarını Taşıma

Daha önce belirtildiği gibi, konteynerin içinde kalan her şey gelecekteki çalışmalar için erişilemez olacaktır. Konteynerden çıkmadan önce, GVCF dosyalarını, nihai çok örnekli VCF'i ve tüm indeks dosyalarını konteynerin dışındaki dosya sistemine manuel olarak taşıyacağız. Bu sayede tüm bu çalışmayı otomatikleştirmek için iş akışımızı oluştururken karşılaştıracak bir şeyimiz olacak.

mv *.vcf* /data/vcf

Dizin içeriği" hl_lines="14-19 22-23

data
├── bam
│   ├── reads_father.bam
│   ├── reads_father.bam.bai
│   ├── reads_mother.bam
│   ├── reads_mother.bam.bai
│   ├── reads_son.bam
│   └── reads_son.bam.bai
├── ref
│   ├── intervals.bed
│   ├── ref.dict
│   ├── ref.fasta
│   └── ref.fasta.fai
├── samplesheet.csv
└── vcf
    ├── family_trio.vcf
    ├── family_trio.vcf.idx
    ├── reads_father.g.vcf
    ├── reads_father.g.vcf.idx
    ├── reads_mother.g.vcf
    ├── reads_mother.g.vcf.idx
    ├── reads_mother.vcf
    ├── reads_mother.vcf.idx
    ├── reads_son.g.vcf
    └── reads_son.g.vcf.idx

Bu işlem tamamlandığında tüm dosyalar normal dosya sisteminizde erişilebilir hale gelir.

2.3.4. GATK Konteynerinden Çıkma

Konteynerden çıkmak için exit yazın.

exit

İstemciniz normale dönmüş olmalıdır. Bu, ortak varyant çağırma komutlarının manuel testini tamamlar.

---

Özetle

Samtools indeksleme ve GATK varyant çağırma komutlarını ilgili konteynerlerinde nasıl test edeceğinizi öğrendiniz; GVCF'lerin nasıl oluşturulacağını ve birden fazla örnek üzerinde ortak genotiplemenin nasıl çalıştırılacağını da bu kapsamda gördünüz.

Sırada ne var?

Kısa bir mola verin, ardından aynı komutları konteynerleri kullanarak çalışmayı yürüten iş akışlarına nasıl saracağınızı öğrenmek için Bölüm 2'ye geçin.