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Parte 1: Descripción del método

Traducción asistida por IA - más información y sugerencias

El llamado de variantes es un método de análisis genómico que tiene como objetivo identificar variaciones en una secuencia genómica en relación con un genoma de referencia. Aquí vamos a usar herramientas y métodos diseñados para llamar variantes germinales cortas, es decir SNPs e indels, en datos de secuenciación de genoma completo.

Pipeline GATK

Un pipeline completo de llamado de variantes típicamente involucra muchos pasos, incluyendo el mapeo a la referencia (a veces referido como alineamiento del genoma) y el filtrado y priorización de variantes. Por simplicidad, en este curso nos vamos a enfocar solo en la parte de llamado de variantes.

Métodos

Vamos a mostrarte dos formas de aplicar el llamado de variantes a muestras de secuenciación de genoma completo para identificar SNPs e indels germinales. Primero comenzaremos con un enfoque simple por muestra que llama variantes independientemente de cada muestra. Luego te mostraremos un enfoque de llamado conjunto más sofisticado que analiza múltiples muestras juntas, produciendo resultados más precisos e informativos.

Antes de escribir cualquier código de workflow para cualquiera de los dos enfoques, vamos a probar los comandos manualmente en algunos datos de prueba.

Conjunto de datos

Proporcionamos los siguientes datos y recursos relacionados:

  • Un genoma de referencia que consiste en una pequeña región del cromosoma humano 20 (de hg19/b37) y sus archivos accesorios (índice y diccionario de secuencia).
  • Tres muestras de secuenciación de genoma completo correspondientes a un trío familiar (madre, padre e hijo), que han sido reducidas a una pequeña porción de datos en el cromosoma 20 para mantener los tamaños de archivo pequeños. Estos son datos de secuenciación Illumina de lecturas cortas que ya han sido mapeados al genoma de referencia, proporcionados en formato BAM (Binary Alignment Map, una versión comprimida de SAM, Sequence Alignment Map).
  • Una lista de intervalos genómicos, es decir, coordenadas en el genoma donde nuestras muestras tienen datos adecuados para llamar variantes, proporcionada en formato BED.

Software

Las dos herramientas principales involucradas son Samtools, un conjunto de herramientas ampliamente utilizado para manipular archivos de alineamiento de secuencias, y GATK (Genome Analysis Toolkit), un conjunto de herramientas para el descubrimiento de variantes desarrollado en el Broad Institute.

Estas herramientas no están instaladas en el entorno de GitHub Codespaces, así que las usaremos a través de contenedores obtenidos mediante el servicio Seqera Containers (ver Hello Containers).

Consejo

Asegúrate de estar en el directorio nf4-science/genomics para que la última parte de la ruta mostrada cuando escribes pwd sea genomics.

1. Llamado de variantes por muestra

El llamado de variantes por muestra procesa cada muestra independientemente: el llamador de variantes examina los datos de secuenciación de una muestra a la vez e identifica posiciones donde la muestra difiere de la referencia.

En esta sección probamos los dos comandos que conforman el enfoque de llamado de variantes por muestra: indexar un archivo BAM con Samtools y llamar variantes con GATK HaplotypeCaller. Estos son los comandos que envolveremos en un workflow de Nextflow en la Parte 2 de este curso.

  1. Generar un archivo índice para un archivo de entrada BAM usando Samtools
  2. Ejecutar GATK HaplotypeCaller en el archivo BAM indexado para generar llamados de variantes por muestra en VCF (Variant Call Format)
BAMSamtools indexBAM indexIntervalsReference+ index & dictGATK HaplotypeCallerVCF + index

Comenzamos probando los dos comandos en solo una muestra.

1.1. Indexar un archivo de entrada BAM con Samtools

Los archivos índice son una característica común de los formatos de archivo bioinformáticos; contienen información sobre la estructura del archivo principal que permite a herramientas como GATK acceder a un subconjunto de los datos sin tener que leer todo el archivo. Esto es importante debido a lo grandes que pueden llegar a ser estos archivos.

Los archivos BAM a menudo se proporcionan sin un índice, por lo que el primer paso en muchos workflows de análisis es generar uno usando samtools index.

Vamos a descargar un contenedor de Samtools, iniciarlo de forma interactiva y ejecutar el comando samtools index en uno de los archivos BAM.

1.1.1. Descargar el contenedor de Samtools

Ejecuta el comando docker pull para descargar la imagen del contenedor de Samtools:

docker pull community.wave.seqera.io/library/samtools:1.20--b5dfbd93de237464
Salida del comando 
1.20--b5dfbd93de237464: Pulling from library/samtools
6360b3717211: Pull complete
2ec3f7ad9b3c: Pull complete
7716ca300600: Pull complete
4f4fb700ef54: Pull complete
8c61d418774c: Pull complete
03dae77ff45c: Pull complete
aab7f787139d: Pull complete
4f4fb700ef54: Pull complete
837d55536720: Pull complete
897362c12ca7: Pull complete
3893cbe24e91: Pull complete
d1b61e94977b: Pull complete
c72ff66fb90f: Pull complete
0e0388f29b6d: Pull complete
Digest: sha256:bbfc45b4f228975bde86cba95e303dd94ecf2fdacea5bfb2e2f34b0d7b141e41
Status: Downloaded newer image for community.wave.seqera.io/library/samtools:1.20--b5dfbd93de237464
community.wave.seqera.io/library/samtools:1.20--b5dfbd93de237464

Si no has descargado esta imagen antes, puede tardar un minuto en completarse. Una vez que termine, tienes una copia local de la imagen del contenedor.

1.1.2. Iniciar el contenedor de Samtools de forma interactiva

Para ejecutar el contenedor de forma interactiva, usa docker run con las opciones -it. La opción -v ./data:/data monta el directorio local data dentro del contenedor para que las herramientas puedan acceder a los archivos de entrada.

docker run -it -v ./data:/data community.wave.seqera.io/library/samtools:1.20--b5dfbd93de237464
Salida del comando 
(base) root@1409896f77b1:/tmp#

Notarás que tu prompt cambia a algo como (base) root@a1b2c3d4e5f6:/tmp#, indicando que ahora estás dentro del contenedor.

Verifica que puedes ver los archivos de datos de secuencia bajo /data/bam:

ls /data/bam
Salida del comando 
reads_father.bam  reads_mother.bam  reads_mother.bam.bai  reads_son.bam

Con eso, estás listo para probar tu primer comando.

1.1.3. Ejecutar el comando de indexación

La documentación de Samtools nos da la línea de comando para ejecutar para indexar un archivo BAM. Solo necesitamos proporcionar el archivo de entrada; la herramienta generará automáticamente un nombre para la salida agregando .bai al nombre del archivo de entrada.

Ejecuta el comando samtools index en un archivo de datos:

samtools index /data/bam/reads_mother.bam

El comando no produce ninguna salida en la terminal, pero ahora deberías ver un archivo llamado reads_mother.bam.bai en el mismo directorio que el archivo de entrada BAM original.

Contenido del directorio 
data/bam/
├── reads_father.bam
├── reads_mother.bam
├── reads_mother.bam.bai
└── reads_son.bam

Eso completa la prueba del primer paso.

1.1.4. Salir del contenedor de Samtools

Para salir del contenedor, escribe exit.

exit

Tu prompt ahora debería volver a lo que era antes de iniciar el contenedor.

1.2. Llamar variantes con GATK HaplotypeCaller

Queremos ejecutar el comando gatk HaplotypeCaller en el archivo BAM que acabamos de indexar.

1.2.1. Descargar el contenedor de GATK

Primero, ejecutemos el comando docker pull para descargar la imagen del contenedor de GATK:

docker pull community.wave.seqera.io/library/gatk4:4.5.0.0--730ee8817e436867
Salida del comando

Algunas capas muestran Already exists porque son compartidas con la imagen del contenedor de Samtools que descargamos anteriormente.

4.5.0.0--730ee8817e436867: Pulling from library/gatk4
6360b3717211: Already exists
2ec3f7ad9b3c: Already exists
7716ca300600: Already exists
4f4fb700ef54: Already exists
8c61d418774c: Already exists
03dae77ff45c: Already exists
aab7f787139d: Already exists
4f4fb700ef54: Already exists
837d55536720: Already exists
897362c12ca7: Already exists
3893cbe24e91: Already exists
d1b61e94977b: Already exists
e5c558f54708: Pull complete
087cce32d294: Pull complete
Digest: sha256:e33413b9100f834fcc62fd5bc9edc1e881e820aafa606e09301eac2303d8724b
Status: Downloaded newer image for community.wave.seqera.io/library/gatk4:4.5.0.0--730ee8817e436867
community.wave.seqera.io/library/gatk4:4.5.0.0--730ee8817e436867

Esto debería ser más rápido que la primera descarga porque las dos imágenes de contenedor comparten la mayoría de sus capas.

1.2.2. Iniciar el contenedor de GATK de forma interactiva

Inicia el contenedor de GATK de forma interactiva con el directorio de datos montado, tal como lo hicimos para Samtools.

docker run -it -v ./data:/data community.wave.seqera.io/library/gatk4:4.5.0.0--730ee8817e436867

Tu prompt cambia para indicar que ahora estás dentro del contenedor de GATK.

1.2.3. Ejecutar el comando de llamado de variantes

La documentación de GATK nos da la línea de comando para ejecutar para realizar el llamado de variantes en un archivo BAM.

Necesitamos proporcionar el archivo de entrada BAM (-I) así como el genoma de referencia (-R), un nombre para el archivo de salida (-O) y una lista de intervalos genómicos a analizar (-L).

Sin embargo, no necesitamos especificar la ruta al archivo índice; la herramienta lo buscará automáticamente en el mismo directorio, basándose en la convención establecida de nomenclatura y ubicación. Lo mismo aplica para los archivos accesorios del genoma de referencia (archivos de índice y diccionario de secuencia, *.fai y *.dict).

gatk HaplotypeCaller \
        -R /data/ref/ref.fasta \
        -I /data/bam/reads_mother.bam \
        -O /data/vcf/reads_mother.vcf \
        -L /data/ref/intervals.bed
Salida del comando 
Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar HaplotypeCaller -R /data/ref/ref.fasta -I /data/bam/reads_mother.bam -O reads_mother.vcf -L /data/ref/intervals.bed
00:27:50.687 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
00:27:50.854 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
00:27:50.858 INFO  HaplotypeCaller - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
00:27:50.858 INFO  HaplotypeCaller - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
00:27:50.858 INFO  HaplotypeCaller - Executing as root@a1fe8ff42d07 on Linux v6.10.14-linuxkit amd64
00:27:50.858 INFO  HaplotypeCaller - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
00:27:50.859 INFO  HaplotypeCaller - Start Date/Time: February 8, 2026 at 12:27:50 AM GMT
00:27:50.859 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
00:27:50.859 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
00:27:50.861 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Version: 4.1.0
00:27:50.861 INFO  HaplotypeCaller - Picard Version: 3.1.1
00:27:50.861 INFO  HaplotypeCaller - Built for Spark Version: 3.5.0
00:27:50.862 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
00:27:50.862 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
00:27:50.862 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
00:27:50.863 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
00:27:50.864 INFO  HaplotypeCaller - Deflater: IntelDeflater
00:27:50.864 INFO  HaplotypeCaller - Inflater: IntelInflater
00:27:50.864 INFO  HaplotypeCaller - GCS max retries/reopens: 20
00:27:50.864 INFO  HaplotypeCaller - Requester pays: disabled
00:27:50.865 INFO  HaplotypeCaller - Initializing engine
00:27:50.991 INFO  FeatureManager - Using codec BEDCodec to read file file:///data/ref/intervals.bed
00:27:51.016 INFO  IntervalArgumentCollection - Processing 6369 bp from intervals
00:27:51.029 INFO  HaplotypeCaller - Done initializing engine
00:27:51.040 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_utils.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_utils.so
00:27:51.042 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_smithwaterman.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_smithwaterman.so
00:27:51.042 INFO  SmithWatermanAligner - Using AVX accelerated SmithWaterman implementation
00:27:51.046 INFO  HaplotypeCallerEngine - Disabling physical phasing, which is supported only for reference-model confidence output
00:27:51.063 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_pairhmm_omp.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_pairhmm_omp.so
00:27:51.085 INFO  IntelPairHmm - Flush-to-zero (FTZ) is enabled when running PairHMM
00:27:51.086 INFO  IntelPairHmm - Available threads: 10
00:27:51.086 INFO  IntelPairHmm - Requested threads: 4
00:27:51.086 INFO  PairHMM - Using the OpenMP multi-threaded AVX-accelerated native PairHMM implementation
00:27:51.128 INFO  ProgressMeter - Starting traversal
00:27:51.136 INFO  ProgressMeter -        Current Locus  Elapsed Minutes     Regions Processed   Regions/Minute
00:27:51.882 WARN  InbreedingCoeff - InbreedingCoeff will not be calculated at position 20_10037292_10066351:3480 and possibly subsequent; at least 10 samples must have called genotypes
00:27:52.969 INFO  HaplotypeCaller - 7 read(s) filtered by: MappingQualityReadFilter
0 read(s) filtered by: MappingQualityAvailableReadFilter
0 read(s) filtered by: MappedReadFilter
0 read(s) filtered by: NotSecondaryAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: NotDuplicateReadFilter
0 read(s) filtered by: PassesVendorQualityCheckReadFilter
0 read(s) filtered by: NonZeroReferenceLengthAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: GoodCigarReadFilter
0 read(s) filtered by: WellformedReadFilter
7 total reads filtered out of 1867 reads processed
00:27:52.971 INFO  ProgressMeter - 20_10037292_10066351:13499              0.0                    35           1145.7
00:27:52.971 INFO  ProgressMeter - Traversal complete. Processed 35 total regions in 0.0 minutes.
00:27:52.976 INFO  VectorLoglessPairHMM - Time spent in setup for JNI call : 0.003346916
00:27:52.976 INFO  PairHMM - Total compute time in PairHMM computeLogLikelihoods() : 0.045731709
00:27:52.977 INFO  SmithWatermanAligner - Total compute time in native Smith-Waterman : 0.02 sec
00:27:52.981 INFO  HaplotypeCaller - Shutting down engine
[February 8, 2026 at 12:27:52 AM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.walkers.haplotypecaller.HaplotypeCaller done. Elapsed time: 0.04 minutes.
Runtime.totalMemory()=203423744

La salida de registro es muy detallada, por lo que hemos resaltado las líneas más relevantes en el ejemplo anterior.

Los archivos de salida, reads_mother.vcf y su archivo índice, reads_mother.vcf.idx, se crean dentro de tu directorio de trabajo en el contenedor.

Contenido del directorio 
conda.yml  hsperfdata_root  reads_mother.vcf  reads_mother.vcf.idx

El archivo VCF contiene los llamados de variantes, como veremos en un minuto, y el archivo índice tiene la misma función que el archivo índice BAM, permitir que las herramientas busquen y recuperen subconjuntos de datos sin cargar todo el archivo.

Como VCF es un formato de texto y este es un archivo de prueba pequeño, puedes ejecutar cat reads_mother.vcf para abrirlo y ver su contenido. Si te desplazas hacia el inicio del archivo, encontrarás un encabezado compuesto de muchas líneas de metadatos, seguido de una lista de llamados de variantes, uno por línea.

Contenidos del archivo (abreviado)
reads_mother.vcf
 1
 2
 3
 4
 5
 6
 7
 8
 9
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12
13
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39
##fileformat=VCFv4.2
##FILTER=<ID=LowQual,Description="Low quality">
##FORMAT=<ID=AD,Number=R,Type=Integer,Description="Allelic depths for the ref and alt alleles in the order listed">
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth (reads with MQ=255 or with bad mates are filtered)">
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">
##FORMAT=<ID=PL,Number=G,Type=Integer,Description="Normalized, Phred-scaled likelihoods for genotypes as defined in the VCF specification">
##GATKCommandLine=<ID=HaplotypeCaller,CommandLine="HaplotypeCaller --output reads_mother.vcf --intervals /data/ref/intervals.bed --input /data/bam/reads_mother.bam --reference /data/ref/ref.fasta [abreviado]",Version="4.5.0.0",Date="February 11, 2026 at 4:23:43 PM GMT">
##INFO=<ID=AC,Number=A,Type=Integer,Description="Allele count in genotypes, for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=AF,Number=A,Type=Float,Description="Allele Frequency, for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=AN,Number=1,Type=Integer,Description="Total number of alleles in called genotypes">
##INFO=<ID=BaseQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt Vs. Ref base qualities">
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth; some reads may have been filtered">
##INFO=<ID=ExcessHet,Number=1,Type=Float,Description="Phred-scaled p-value for exact test of excess heterozygosity">
##INFO=<ID=FS,Number=1,Type=Float,Description="Phred-scaled p-value using Fisher's exact test to detect strand bias">
##INFO=<ID=InbreedingCoeff,Number=1,Type=Float,Description="Inbreeding coefficient as estimated from the genotype likelihoods per-sample when compared against the Hardy-Weinberg expectation">
##INFO=<ID=MLEAC,Number=A,Type=Integer,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele counts (not necessarily the same as the AC), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MLEAF,Number=A,Type=Float,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele frequency (not necessarily the same as the AF), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MQ,Number=1,Type=Float,Description="RMS Mapping Quality">
##INFO=<ID=MQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score From Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read mapping qualities">
##INFO=<ID=QD,Number=1,Type=Float,Description="Variant Confidence/Quality by Depth">
##INFO=<ID=ReadPosRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read position bias">
##INFO=<ID=SOR,Number=1,Type=Float,Description="Symmetric Odds Ratio of 2x2 contingency table to detect strand bias">
##contig=<ID=20_10037292_10066351,length=29059>
##source=HaplotypeCaller
#CHROM  POS     ID      REF     ALT     QUAL    FILTER  INFO    FORMAT  reads_mother
20_10037292_10066351    3480    .       C       CT      503.03  .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=23;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=27.95;SOR=1.179     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,18:18:54:517,54,0
20_10037292_10066351    3520    .       AT      A       609.03  .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=18;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=33.83;SOR=0.693     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,18:18:54:623,54,0
20_10037292_10066351    3529    .       T       A       155.64  .       AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=-0.544;DP=21;ExcessHet=0.0000;FS=1.871;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.000;QD=7.78;ReadPosRankSum=-1.158;SOR=1.034       GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:12,8:20:99:163,0,328
20_10037292_10066351    4012    .       C       T       1398.06 .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=44;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=32.51;SOR=0.739     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,43:43:99:1412,129,0
20_10037292_10066351    4409    .       A       ATATG   710.03  .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=31;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=30.87;SOR=0.784     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,23:23:69:724,69,0
20_10037292_10066351    5027    .       C       T       784.06  .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=27;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=30.16;SOR=0.693     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,26:26:77:798,77,0
20_10037292_10066351    5469    .       A       G       1297.06 .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=42;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=30.88;SOR=1.005     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,42:42:99:1311,126,0
20_10037292_10066351    7557    .       A       G       935.06  .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=36;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=27.50;SOR=0.693     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,34:34:99:949,100,0
20_10037292_10066351    7786    .       G       T       1043.06 .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=35;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=30.68;SOR=0.941     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,34:34:99:1057,102,0
20_10037292_10066351    8350    .       G       C       1162.06 .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=39;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=29.80;SOR=1.096     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,39:39:99:1176,115,0
20_10037292_10066351    8886    .       AAGAAAGAAAG     A       1268.03 .       AC=2;AF=1.00;AN=2;DP=34;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=2;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=25.36;SOR=1.071     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,29:29:88:1282,88,0
20_10037292_10066351    13536   .       T       C       437.64  .       AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=1.454;DP=45;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.000;QD=9.95;ReadPosRankSum=-1.613;SOR=0.818        GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:26,18:44:99:445,0,672
20_10037292_10066351    14156   .       T       C       183.64  .       AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=0.703;DP=20;ExcessHet=0.0000;FS=1.871;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.000;QD=9.18;ReadPosRankSum=-0.193;SOR=1.034        GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:12,8:20:99:191,0,319

En la salida de ejemplo anterior, hemos resaltado la última línea del encabezado, que marca el inicio de los datos de llamados de variantes. Cada línea de datos describe una posible variante identificada en los datos de secuenciación de la muestra. Para orientación sobre cómo interpretar el formato VCF, consulta este artículo útil.

1.2.4. Mover los archivos de salida

Cualquier cosa que permanezca dentro del contenedor será inaccesible para trabajo futuro. El archivo índice BAM se creó directamente en el directorio /data/bam en el sistema de archivos montado, pero no el archivo VCF y su índice, por lo que necesitamos mover esos dos manualmente.

mkdir /data/vcf
mv reads_mother.vcf* /data/vcf
Contenido del directorio 
data/
├── bam
│   ├── reads_father.bam
│   ├── reads_mother.bam
│   ├── reads_mother.bam.bai
│   └── reads_son.bam
├── ref
│   ├── intervals.bed
│   ├── ref.dict
│   ├── ref.fasta
│   └── ref.fasta.fai
├── samplesheet.csv
└── vcf
    ├── reads_mother.vcf
    └── reads_mother.vcf.idx

Una vez hecho esto, todos los archivos ahora son accesibles en tu sistema de archivos normal.

1.2.5. Salir del contenedor de GATK

Para salir del contenedor, escribe exit.

exit

Tu prompt debería volver a la normalidad. Eso concluye la prueba de llamado de variantes por muestra.

¡Escríbelo como un workflow!

Siéntete libre de pasar directamente a la Parte 2 si deseas comenzar a implementar este análisis como un workflow de Nextflow. Solo necesitarás volver para completar la segunda ronda de pruebas antes de pasar a la Parte 3.

2. Llamado conjunto en una cohorte

El enfoque de llamado de variantes que acabamos de usar genera llamados de variantes por muestra. Eso está bien para observar variantes de cada muestra de forma aislada, pero produce información limitada. A menudo es más interesante observar cómo difieren los llamados de variantes entre múltiples muestras. GATK ofrece un método alternativo llamado llamado conjunto de variantes para este propósito.

El llamado conjunto de variantes implica generar un tipo especial de salida de variantes llamada GVCF (por Genomic VCF) para cada muestra, luego combinar los datos GVCF de todas las muestras y ejecutar un análisis estadístico de 'genotipado conjunto'.

Análisis conjunto

Lo que es especial sobre el GVCF de una muestra es que contiene registros que resumen estadísticas de datos de secuencia sobre todas las posiciones en el área objetivo del genoma, no solo las posiciones donde el programa encontró evidencia de variación. Esto es crítico para el cálculo de genotipado conjunto (lectura adicional).

El GVCF es producido por GATK HaplotypeCaller, la misma herramienta que acabamos de probar, con un parámetro adicional (-ERC GVCF). La combinación de los GVCFs se realiza con GATK GenomicsDBImport, que combina los llamados por muestra en un almacén de datos (análogo a una base de datos). El análisis de 'genotipado conjunto' propiamente dicho se realiza entonces con GATK GenotypeGVCFs.

Aquí probamos los comandos necesarios para generar GVCFs y ejecutar el genotipado conjunto. Estos son los comandos que envolveremos en un workflow de Nextflow en la Parte 3 de este curso.

  1. Generar un archivo índice para cada archivo de entrada BAM usando Samtools
  2. Ejecutar GATK HaplotypeCaller en cada archivo de entrada BAM para generar un GVCF de llamados de variantes genómicas por muestra
  3. Recolectar todos los GVCFs y combinarlos en un almacén de datos GenomicsDB
  4. Ejecutar el genotipado conjunto en el almacén de datos GVCF combinado para producir un VCF a nivel de cohorte
BAMSamtools indexBAM indexIntervalsReference+ index & dictGATK HaplotypeCallerGVCF + indexx multiple samplesGVCF + indexGVCF + indexGVCF + indexGenomicsDBvariant storeGATK GenomicsDBImportGATK GenotypeGVCFsJoint-calledVCFGVCF mode

Ahora necesitamos probar todos estos comandos, comenzando con la indexación de los tres archivos BAM.

2.1. Indexar archivos BAM para las tres muestras

En la primera sección anterior, solo indexamos un archivo BAM. Ahora necesitamos indexar las tres muestras para que GATK HaplotypeCaller pueda procesarlas.

2.1.1. Iniciar el contenedor de Samtools de forma interactiva

Ya descargamos la imagen del contenedor de Samtools, así que podemos iniciarlo directamente:

docker run -it -v ./data:/data community.wave.seqera.io/library/samtools:1.20--b5dfbd93de237464

Tu prompt cambia para indicar que estás dentro del contenedor, con el directorio de datos montado como antes.

2.1.2. Ejecutar el comando de indexación en las tres muestras

Ejecuta el comando de indexación en cada uno de los tres archivos BAM:

samtools index /data/bam/reads_mother.bam
samtools index /data/bam/reads_father.bam
samtools index /data/bam/reads_son.bam
Contenido del directorio 
data/bam/
├── reads_father.bam
├── reads_father.bam.bai
├── reads_mother.bam
├── reads_mother.bam.bai
├── reads_son.bam
└── reads_son.bam.bai

Esto debería producir los archivos índice en el mismo directorio que los archivos BAM correspondientes.

2.1.3. Salir del contenedor de Samtools

Para salir del contenedor, escribe exit.

exit

Tu prompt debería volver a la normalidad.

2.2. Generar GVCFs para las tres muestras

Para ejecutar el paso de genotipado conjunto, necesitamos GVCFs para las tres muestras.

2.2.1. Iniciar el contenedor de GATK de forma interactiva

Ya descargamos la imagen del contenedor de GATK anteriormente, así que podemos iniciarlo directamente:

docker run -it -v ./data:/data community.wave.seqera.io/library/gatk4:4.5.0.0--730ee8817e436867

Tu prompt cambia para indicar que estás dentro del contenedor de GATK.

2.2.2. Ejecutar el comando de llamado de variantes con la opción GVCF

Para producir un VCF genómico (GVCF), agregamos la opción -ERC GVCF al comando base, que activa el modo GVCF de HaplotypeCaller.

También cambiamos la extensión del archivo de salida de .vcf a .g.vcf. Esto técnicamente no es un requisito, pero es una convención fuertemente recomendada.

gatk HaplotypeCaller \
        -R /data/ref/ref.fasta \
        -I /data/bam/reads_mother.bam \
        -O reads_mother.g.vcf \
        -L /data/ref/intervals.bed \
        -ERC GVCF
Salida del comando 
Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar HaplotypeCaller -R /data/ref/ref.fasta -I /data/bam/reads_mother.bam -O reads_mother.g.vcf -L /data/ref/intervals.bed -ERC GVCF
16:51:00.620 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
16:51:00.749 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
16:51:00.751 INFO  HaplotypeCaller - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
16:51:00.751 INFO  HaplotypeCaller - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
16:51:00.751 INFO  HaplotypeCaller - Executing as root@be1a0302f6c7 on Linux v6.8.0-1030-azure amd64
16:51:00.751 INFO  HaplotypeCaller - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
16:51:00.752 INFO  HaplotypeCaller - Start Date/Time: February 11, 2026 at 4:51:00 PM GMT
16:51:00.752 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
16:51:00.752 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
16:51:00.752 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Version: 4.1.0
16:51:00.753 INFO  HaplotypeCaller - Picard Version: 3.1.1
16:51:00.753 INFO  HaplotypeCaller - Built for Spark Version: 3.5.0
16:51:00.753 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
16:51:00.753 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
16:51:00.753 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
16:51:00.754 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
16:51:00.754 INFO  HaplotypeCaller - Deflater: IntelDeflater
16:51:00.754 INFO  HaplotypeCaller - Inflater: IntelInflater
16:51:00.754 INFO  HaplotypeCaller - GCS max retries/reopens: 20
16:51:00.754 INFO  HaplotypeCaller - Requester pays: disabled
16:51:00.755 INFO  HaplotypeCaller - Initializing engine
16:51:00.893 INFO  FeatureManager - Using codec BEDCodec to read file file:///data/ref/intervals.bed
16:51:00.905 INFO  IntervalArgumentCollection - Processing 6369 bp from intervals
16:51:00.910 INFO  HaplotypeCaller - Done initializing engine
16:51:00.912 INFO  HaplotypeCallerEngine - Tool is in reference confidence mode and the annotation, the following changes will be made to any specified annotations: 'StrandBiasBySample' will be enabled. 'ChromosomeCounts', 'FisherStrand', 'StrandOddsRatio' and 'QualByDepth' annotations have been disabled
16:51:00.917 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_utils.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_utils.so
16:51:00.919 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_smithwaterman.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_smithwaterman.so
16:51:00.919 INFO  SmithWatermanAligner - Using AVX accelerated SmithWaterman implementation
16:51:00.923 INFO  HaplotypeCallerEngine - Standard Emitting and Calling confidence set to -0.0 for reference-model confidence output
16:51:00.923 INFO  HaplotypeCallerEngine - All sites annotated with PLs forced to true for reference-model confidence output
16:51:00.933 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_pairhmm_omp.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_pairhmm_omp.so
16:51:00.945 INFO  IntelPairHmm - Flush-to-zero (FTZ) is enabled when running PairHMM
16:51:00.945 INFO  IntelPairHmm - Available threads: 4
16:51:00.945 INFO  IntelPairHmm - Requested threads: 4
16:51:00.945 INFO  PairHMM - Using the OpenMP multi-threaded AVX-accelerated native PairHMM implementation
16:51:00.984 INFO  ProgressMeter - Starting traversal
16:51:00.985 INFO  ProgressMeter -        Current Locus  Elapsed Minutes     Regions Processed   Regions/Minute
16:51:01.452 WARN  InbreedingCoeff - InbreedingCoeff will not be calculated at position 20_10037292_10066351:3480 and possibly subsequent; at least 10 samples must have called genotypes
16:51:02.358 INFO  HaplotypeCaller - 7 read(s) filtered by: MappingQualityReadFilter
0 read(s) filtered by: MappingQualityAvailableReadFilter
0 read(s) filtered by: MappedReadFilter
0 read(s) filtered by: NotSecondaryAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: NotDuplicateReadFilter
0 read(s) filtered by: PassesVendorQualityCheckReadFilter
0 read(s) filtered by: NonZeroReferenceLengthAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: GoodCigarReadFilter
0 read(s) filtered by: WellformedReadFilter
7 total reads filtered out of 1867 reads processed
16:51:02.359 INFO  ProgressMeter - 20_10037292_10066351:13499              0.0                    35           1529.5
16:51:02.359 INFO  ProgressMeter - Traversal complete. Processed 35 total regions in 0.0 minutes.
16:51:02.361 INFO  VectorLoglessPairHMM - Time spent in setup for JNI call : 0.0022800000000000003
16:51:02.361 INFO  PairHMM - Total compute time in PairHMM computeLogLikelihoods() : 0.061637120000000004
16:51:02.361 INFO  SmithWatermanAligner - Total compute time in native Smith-Waterman : 0.02 sec
16:51:02.362 INFO  HaplotypeCaller - Shutting down engine
[February 11, 2026 at 4:51:02 PM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.walkers.haplotypecaller.HaplotypeCaller done. Elapsed time: 0.03 minutes.
Runtime.totalMemory()=257949696

Esto crea el archivo de salida GVCF reads_mother.g.vcf en el directorio de trabajo actual en el contenedor, así como su archivo índice, reads_mother.g.vcf.idx.

Contenido del directorio 
conda.yml  hsperfdata_root  reads_mother.g.vcf  reads_mother.g.vcf.idx

Si ejecutas head -200 reads_mother.g.vcf para ver las primeras 200 líneas del contenido del archivo, verás que es mucho más largo que el VCF equivalente que generamos en la primera sección, y la mayoría de las líneas se ven bastante diferentes de lo que vimos en el VCF.

Contenidos del archivo (abreviado)
reads_mother.g.vcf
  1
  2
  3
  4
  5
  6
  7
  8
  9
 10
 11
 12
 13
 14
 15
 16
 17
 18
 19
 20
 21
 22
 23
 24
 25
 26
 27
 28
 29
 30
 31
 32
 33
 34
 35
 36
 37
 38
 39
 40
 41
 42
 43
 44
 45
 46
 47
 48
 49
 50
 51
 52
 53
 54
 55
 56
 57
 58
 59
 60
 61
 62
 63
 64
 65
 66
 67
 68
 69
 70
 71
 72
 73
 74
 75
 76
 77
 78
 79
 80
 81
 82
 83
 84
 85
 86
 87
 88
 89
 90
 91
 92
 93
 94
 95
 96
 97
 98
 99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
##fileformat=VCFv4.2
##ALT=<ID=NON_REF,Description="Represents any possible alternative allele not already represented at this location by REF and ALT">
##FILTER=<ID=LowQual,Description="Low quality">
##FORMAT=<ID=AD,Number=R,Type=Integer,Description="Allelic depths for the ref and alt alleles in the order listed">
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth (reads with MQ=255 or with bad mates are filtered)">
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">
##FORMAT=<ID=MIN_DP,Number=1,Type=Integer,Description="Minimum DP observed within the GVCF block">
##FORMAT=<ID=PGT,Number=1,Type=String,Description="Physical phasing haplotype information, describing how the alternate alleles are phased in relation to one another; will always be heterozygous and is not intended to describe called alleles">
##FORMAT=<ID=PID,Number=1,Type=String,Description="Physical phasing ID information, where each unique ID within a given sample (but not across samples) connects records within a phasing group">
##FORMAT=<ID=PL,Number=G,Type=Integer,Description="Normalized, Phred-scaled likelihoods for genotypes as defined in the VCF specification">
##FORMAT=<ID=PS,Number=1,Type=Integer,Description="Phasing set (typically the position of the first variant in the set)">
##FORMAT=<ID=SB,Number=4,Type=Integer,Description="Per-sample component statistics which comprise the Fisher's Exact Test to detect strand bias.">
##GATKCommandLine=<ID=HaplotypeCaller,CommandLine="HaplotypeCaller --emit-ref-confidence GVCF --output reads_mother.g.vcf --intervals /data/ref/intervals.bed --input /data/bam/reads_mother.bam --reference /data/ref/ref.fasta [abreviado]",Version="4.5.0.0",Date="February 11, 2026 at 4:51:00 PM GMT">
##GVCFBlock0-1=minGQ=0(inclusive),maxGQ=1(exclusive)
##GVCFBlock1-2=minGQ=1(inclusive),maxGQ=2(exclusive)
##GVCFBlock10-11=minGQ=10(inclusive),maxGQ=11(exclusive)
##GVCFBlock11-12=minGQ=11(inclusive),maxGQ=12(exclusive)
##GVCFBlock12-13=minGQ=12(inclusive),maxGQ=13(exclusive)
##GVCFBlock13-14=minGQ=13(inclusive),maxGQ=14(exclusive)
##GVCFBlock14-15=minGQ=14(inclusive),maxGQ=15(exclusive)
##GVCFBlock15-16=minGQ=15(inclusive),maxGQ=16(exclusive)
##GVCFBlock16-17=minGQ=16(inclusive),maxGQ=17(exclusive)
##GVCFBlock17-18=minGQ=17(inclusive),maxGQ=18(exclusive)
##GVCFBlock18-19=minGQ=18(inclusive),maxGQ=19(exclusive)
##GVCFBlock19-20=minGQ=19(inclusive),maxGQ=20(exclusive)
##GVCFBlock2-3=minGQ=2(inclusive),maxGQ=3(exclusive)
##GVCFBlock20-21=minGQ=20(inclusive),maxGQ=21(exclusive)
##GVCFBlock21-22=minGQ=21(inclusive),maxGQ=22(exclusive)
##GVCFBlock22-23=minGQ=22(inclusive),maxGQ=23(exclusive)
##GVCFBlock23-24=minGQ=23(inclusive),maxGQ=24(exclusive)
##GVCFBlock24-25=minGQ=24(inclusive),maxGQ=25(exclusive)
##GVCFBlock25-26=minGQ=25(inclusive),maxGQ=26(exclusive)
##GVCFBlock26-27=minGQ=26(inclusive),maxGQ=27(exclusive)
##GVCFBlock27-28=minGQ=27(inclusive),maxGQ=28(exclusive)
##GVCFBlock28-29=minGQ=28(inclusive),maxGQ=29(exclusive)
##GVCFBlock29-30=minGQ=29(inclusive),maxGQ=30(exclusive)
##GVCFBlock3-4=minGQ=3(inclusive),maxGQ=4(exclusive)
##GVCFBlock30-31=minGQ=30(inclusive),maxGQ=31(exclusive)
##GVCFBlock31-32=minGQ=31(inclusive),maxGQ=32(exclusive)
##GVCFBlock32-33=minGQ=32(inclusive),maxGQ=33(exclusive)
##GVCFBlock33-34=minGQ=33(inclusive),maxGQ=34(exclusive)
##GVCFBlock34-35=minGQ=34(inclusive),maxGQ=35(exclusive)
##GVCFBlock35-36=minGQ=35(inclusive),maxGQ=36(exclusive)
##GVCFBlock36-37=minGQ=36(inclusive),maxGQ=37(exclusive)
##GVCFBlock37-38=minGQ=37(inclusive),maxGQ=38(exclusive)
##GVCFBlock38-39=minGQ=38(inclusive),maxGQ=39(exclusive)
##GVCFBlock39-40=minGQ=39(inclusive),maxGQ=40(exclusive)
##GVCFBlock4-5=minGQ=4(inclusive),maxGQ=5(exclusive)
##GVCFBlock40-41=minGQ=40(inclusive),maxGQ=41(exclusive)
##GVCFBlock41-42=minGQ=41(inclusive),maxGQ=42(exclusive)
##GVCFBlock42-43=minGQ=42(inclusive),maxGQ=43(exclusive)
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##INFO=<ID=END,Number=1,Type=Integer,Description="Stop position of the interval">
##INFO=<ID=ExcessHet,Number=1,Type=Float,Description="Phred-scaled p-value for exact test of excess heterozygosity">
##INFO=<ID=InbreedingCoeff,Number=1,Type=Float,Description="Inbreeding coefficient as estimated from the genotype likelihoods per-sample when compared against the Hardy-Weinberg expectation">
##INFO=<ID=MLEAC,Number=A,Type=Integer,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele counts (not necessarily the same as the AC), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MLEAF,Number=A,Type=Float,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele frequency (not necessarily the same as the AF), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score From Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read mapping qualities">
##INFO=<ID=RAW_MQandDP,Number=2,Type=Integer,Description="Raw data (sum of squared MQ and total depth) for improved RMS Mapping Quality calculation. Incompatible with deprecated RAW_MQ formulation.">
##INFO=<ID=ReadPosRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read position bias">
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20_10037292_10066351	3471	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3478	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:32:75:32:0,75,1125
20_10037292_10066351	3479	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3479	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:34:36:34:0,36,906
20_10037292_10066351	3480	.	C	CT,<NON_REF>	503.03	.	DP=23;ExcessHet=0.0000;MLEAC=2,0;MLEAF=1.00,0.00;RAW_MQandDP=82800,23	GT:AD:DP:GQ:PL:SB	1/1:0,18,0:18:54:517,54,0,517,54,517:0,0,7,11
20_10037292_10066351	3481	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3481	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:21:51:21:0,51,765
20_10037292_10066351	3482	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3482	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:21:54:21:0,54,810
20_10037292_10066351	3483	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3487	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:20:51:19:0,51,765
20_10037292_10066351	3488	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3488	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:42:19:0,42,571
20_10037292_10066351	3489	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3489	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:17:51:17:0,51,521
20_10037292_10066351	3490	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3490	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:17:35:17:0,35,431
20_10037292_10066351	3491	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3495	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:17:48:17:0,48,720
20_10037292_10066351	3496	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3498	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:17:51:17:0,51,473
20_10037292_10066351	3499	.	C	<NON_REF>	.	.	END=3499	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:16:48:16:0,48,428
20_10037292_10066351	3500	.	G	<NON_REF>	.	.	END=3500	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:16:31:16:0,31,379
20_10037292_10066351	3501	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3501	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:17:48:17:0,48,720
20_10037292_10066351	3502	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3503	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:54:18:0,54,550
20_10037292_10066351	3504	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3504	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:48:19:0,48,720
20_10037292_10066351	3505	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3506	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:20:51:20:0,51,765
20_10037292_10066351	3507	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3519	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:54:18:0,54,501
20_10037292_10066351	3520	.	AT	A,<NON_REF>	609.03	.	DP=18;ExcessHet=0.0000;MLEAC=2,0;MLEAF=1.00,0.00;RAW_MQandDP=64800,18	GT:AD:DP:GQ:PL:SB	1/1:0,18,0:18:54:623,54,0,623,54,623:0,0,9,9
20_10037292_10066351	3522	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3525	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:18:54:18:0,54,550
20_10037292_10066351	3526	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3527	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:57:19:0,57,607
20_10037292_10066351	3528	.	T	<NON_REF>	.	.	END=3528	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:19:54:19:0,54,810
20_10037292_10066351	3529	.	T	A,<NON_REF>	155.64	.	BaseQRankSum=-0.544;DP=21;ExcessHet=0.0000;MLEAC=1,0;MLEAF=0.500,0.00;MQRankSum=0.000;RAW_MQandDP=75600,21;ReadPosRankSum=-1.158	GT:AD:DP:GQ:PL:SB	0/1:12,8,0:20:99:163,0,328,199,352,551:5,7,5,3
20_10037292_10066351	3530	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3530	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:64:33:0,64,941
20_10037292_10066351	3531	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3533	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:81:33:0,81,1215
20_10037292_10066351	3534	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3534	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:78:33:0,78,1170
20_10037292_10066351	3535	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3536	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:33:68:33:0,68,891
20_10037292_10066351	3537	.	A	<NON_REF>	.	.	END=3546	GT:DP:GQ:MIN_DP:PL	0/0:29:72:26:0,72,1080

Hemos resaltado una vez más la última línea del encabezado, así como los primeros tres llamados de variantes 'propiamente dichos' en el archivo.

Notarás que las líneas de llamados de variantes están intercaladas con muchas líneas no variantes, que representan regiones no variantes donde el llamador de variantes no encontró evidencia de variación. Como se mencionó brevemente arriba, esto es lo que es especial sobre el modo GVCF de llamado de variantes: el llamador de variantes captura algunas estadísticas que describen su nivel de confianza en la ausencia de variación. Esto hace posible distinguir entre dos cifras de casos muy diferentes: (1) hay datos de buena calidad que muestran que la muestra es homocigota-referencia, y (2) no hay suficientes datos buenos disponibles para hacer una determinación de cualquier manera.

En un GVCF como este, típicamente hay muchas de estas líneas no variantes, con un número menor de registros de variantes dispersos entre ellas.

2.2.3. Repetir el proceso en las otras dos muestras

Ahora generemos GVCFs para las dos muestras restantes ejecutando los comandos a continuación, uno tras otro.

gatk HaplotypeCaller \
        -R /data/ref/ref.fasta \
        -I /data/bam/reads_father.bam \
        -O reads_father.g.vcf \
        -L /data/ref/intervals.bed \
        -ERC GVCF
Salida del comando 
Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar HaplotypeCaller -R /data/ref/ref.fasta -I /data/bam/reads_father.bam -O reads_father.g.vcf -L /data/ref/intervals.bed -ERC GVCF
17:28:30.677 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
17:28:30.801 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:28:30.803 INFO  HaplotypeCaller - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - Executing as root@be1a0302f6c7 on Linux v6.8.0-1030-azure amd64
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - Start Date/Time: February 11, 2026 at 5:28:30 PM GMT
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:28:30.804 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:28:30.805 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Version: 4.1.0
17:28:30.805 INFO  HaplotypeCaller - Picard Version: 3.1.1
17:28:30.805 INFO  HaplotypeCaller - Built for Spark Version: 3.5.0
17:28:30.806 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
17:28:30.806 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
17:28:30.806 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
17:28:30.806 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
17:28:30.806 INFO  HaplotypeCaller - Deflater: IntelDeflater
17:28:30.807 INFO  HaplotypeCaller - Inflater: IntelInflater
17:28:30.807 INFO  HaplotypeCaller - GCS max retries/reopens: 20
17:28:30.807 INFO  HaplotypeCaller - Requester pays: disabled
17:28:30.807 INFO  HaplotypeCaller - Initializing engine
17:28:30.933 INFO  FeatureManager - Using codec BEDCodec to read file file:///data/ref/intervals.bed
17:28:30.946 INFO  IntervalArgumentCollection - Processing 6369 bp from intervals
17:28:30.951 INFO  HaplotypeCaller - Done initializing engine
17:28:30.953 INFO  HaplotypeCallerEngine - Tool is in reference confidence mode and the annotation, the following changes will be made to any specified annotations: 'StrandBiasBySample' will be enabled. 'ChromosomeCounts', 'FisherStrand', 'StrandOddsRatio' and 'QualByDepth' annotations have been disabled
17:28:30.957 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_utils.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_utils.so
17:28:30.959 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_smithwaterman.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_smithwaterman.so
17:28:30.960 INFO  SmithWatermanAligner - Using AVX accelerated SmithWaterman implementation
17:28:30.963 INFO  HaplotypeCallerEngine - Standard Emitting and Calling confidence set to -0.0 for reference-model confidence output
17:28:30.963 INFO  HaplotypeCallerEngine - All sites annotated with PLs forced to true for reference-model confidence output
17:28:30.972 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_pairhmm_omp.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_pairhmm_omp.so
17:28:30.987 INFO  IntelPairHmm - Flush-to-zero (FTZ) is enabled when running PairHMM
17:28:30.987 INFO  IntelPairHmm - Available threads: 4
17:28:30.987 INFO  IntelPairHmm - Requested threads: 4
17:28:30.987 INFO  PairHMM - Using the OpenMP multi-threaded AVX-accelerated native PairHMM implementation
17:28:31.034 INFO  ProgressMeter - Starting traversal
17:28:31.034 INFO  ProgressMeter -        Current Locus  Elapsed Minutes     Regions Processed   Regions/Minute
17:28:31.570 WARN  InbreedingCoeff - InbreedingCoeff will not be calculated at position 20_10037292_10066351:3480 and possibly subsequent; at least 10 samples must have called genotypes
17:28:32.865 INFO  HaplotypeCaller - 9 read(s) filtered by: MappingQualityReadFilter
0 read(s) filtered by: MappingQualityAvailableReadFilter
0 read(s) filtered by: MappedReadFilter
0 read(s) filtered by: NotSecondaryAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: NotDuplicateReadFilter
0 read(s) filtered by: PassesVendorQualityCheckReadFilter
0 read(s) filtered by: NonZeroReferenceLengthAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: GoodCigarReadFilter
0 read(s) filtered by: WellformedReadFilter
9 total reads filtered out of 2064 reads processed
17:28:32.866 INFO  ProgressMeter - 20_10037292_10066351:13338              0.0                    38           1245.2
17:28:32.866 INFO  ProgressMeter - Traversal complete. Processed 38 total regions in 0.0 minutes.
17:28:32.868 INFO  VectorLoglessPairHMM - Time spent in setup for JNI call : 0.0035923200000000004
17:28:32.868 INFO  PairHMM - Total compute time in PairHMM computeLogLikelihoods() : 0.10765202500000001
17:28:32.868 INFO  SmithWatermanAligner - Total compute time in native Smith-Waterman : 0.03 sec
17:28:32.869 INFO  HaplotypeCaller - Shutting down engine
[February 11, 2026 at 5:28:32 PM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.walkers.haplotypecaller.HaplotypeCaller done. Elapsed time: 0.04 minutes.
Runtime.totalMemory()=299892736

gatk HaplotypeCaller \
        -R /data/ref/ref.fasta \
        -I /data/bam/reads_son.bam \
        -O reads_son.g.vcf \
        -L /data/ref/intervals.bed \
        -ERC GVCF
Salida del comando 
Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar HaplotypeCaller -R /data/ref/ref.fasta -I /data/bam/reads_son.bam -O reads_son.g.vcf -L /data/ref/intervals.bed -ERC GVCF
17:30:10.017 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
17:30:10.156 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - Executing as root@be1a0302f6c7 on Linux v6.8.0-1030-azure amd64
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - Start Date/Time: February 11, 2026 at 5:30:09 PM GMT
17:30:10.159 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:30:10.160 INFO  HaplotypeCaller - ------------------------------------------------------------
17:30:10.160 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Version: 4.1.0
17:30:10.160 INFO  HaplotypeCaller - Picard Version: 3.1.1
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - Built for Spark Version: 3.5.0
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
17:30:10.161 INFO  HaplotypeCaller - Deflater: IntelDeflater
17:30:10.162 INFO  HaplotypeCaller - Inflater: IntelInflater
17:30:10.162 INFO  HaplotypeCaller - GCS max retries/reopens: 20
17:30:10.162 INFO  HaplotypeCaller - Requester pays: disabled
17:30:10.162 INFO  HaplotypeCaller - Initializing engine
17:30:10.277 INFO  FeatureManager - Using codec BEDCodec to read file file:///data/ref/intervals.bed
17:30:10.290 INFO  IntervalArgumentCollection - Processing 6369 bp from intervals
17:30:10.296 INFO  HaplotypeCaller - Done initializing engine
17:30:10.298 INFO  HaplotypeCallerEngine - Tool is in reference confidence mode and the annotation, the following changes will be made to any specified annotations: 'StrandBiasBySample' will be enabled. 'ChromosomeCounts', 'FisherStrand', 'StrandOddsRatio' and 'QualByDepth' annotations have been disabled
17:30:10.302 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_utils.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_utils.so
17:30:10.303 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_smithwaterman.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_smithwaterman.so
17:30:10.304 INFO  SmithWatermanAligner - Using AVX accelerated SmithWaterman implementation
17:30:10.307 INFO  HaplotypeCallerEngine - Standard Emitting and Calling confidence set to -0.0 for reference-model confidence output
17:30:10.307 INFO  HaplotypeCallerEngine - All sites annotated with PLs forced to true for reference-model confidence output
17:30:10.315 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_pairhmm_omp.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_pairhmm_omp.so
17:30:10.328 INFO  IntelPairHmm - Flush-to-zero (FTZ) is enabled when running PairHMM
17:30:10.329 INFO  IntelPairHmm - Available threads: 4
17:30:10.329 INFO  IntelPairHmm - Requested threads: 4
17:30:10.329 INFO  PairHMM - Using the OpenMP multi-threaded AVX-accelerated native PairHMM implementation
17:30:10.368 INFO  ProgressMeter - Starting traversal
17:30:10.369 INFO  ProgressMeter -        Current Locus  Elapsed Minutes     Regions Processed   Regions/Minute
17:30:10.875 WARN  InbreedingCoeff - InbreedingCoeff will not be calculated at position 20_10037292_10066351:3480 and possibly subsequent; at least 10 samples must have called genotypes
17:30:11.980 INFO  HaplotypeCaller - 14 read(s) filtered by: MappingQualityReadFilter
0 read(s) filtered by: MappingQualityAvailableReadFilter
0 read(s) filtered by: MappedReadFilter
0 read(s) filtered by: NotSecondaryAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: NotDuplicateReadFilter
0 read(s) filtered by: PassesVendorQualityCheckReadFilter
0 read(s) filtered by: NonZeroReferenceLengthAlignmentReadFilter
0 read(s) filtered by: GoodCigarReadFilter
0 read(s) filtered by: WellformedReadFilter
14 total reads filtered out of 1981 reads processed
17:30:11.981 INFO  ProgressMeter - 20_10037292_10066351:13223              0.0                    35           1302.7
17:30:11.981 INFO  ProgressMeter - Traversal complete. Processed 35 total regions in 0.0 minutes.
17:30:11.983 INFO  VectorLoglessPairHMM - Time spent in setup for JNI call : 0.0034843710000000004
17:30:11.983 INFO  PairHMM - Total compute time in PairHMM computeLogLikelihoods() : 0.048108363
17:30:11.983 INFO  SmithWatermanAligner - Total compute time in native Smith-Waterman : 0.02 sec
17:30:11.984 INFO  HaplotypeCaller - Shutting down engine
[February 11, 2026 at 5:30:11 PM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.walkers.haplotypecaller.HaplotypeCaller done. Elapsed time: 0.03 minutes.
Runtime.totalMemory()=226492416

Una vez que esto se complete, deberías tener tres archivos que terminan en .g.vcf en tu directorio actual (uno por muestra) y sus respectivos archivos índice que terminan en .g.vcf.idx.

Contenido del directorio 
conda.yml        reads_father.g.vcf      reads_mother.g.vcf      reads_son.g.vcf
hsperfdata_root  reads_father.g.vcf.idx  reads_mother.g.vcf.idx  reads_son.g.vcf.idx

En este punto, hemos llamado variantes en modo GVCF para cada una de nuestras muestras de entrada. Es hora de pasar al llamado conjunto.

¡Pero no salgas del contenedor! Vamos a usar el mismo en el siguiente paso.

2.3. Ejecutar el genotipado conjunto

Ahora que tenemos todos los GVCFs, podemos probar el enfoque de genotipado conjunto para generar llamados de variantes para una cohorte de muestras. Es un método de dos pasos que consiste en combinar los datos de todos los GVCFs en un almacén de datos, luego ejecutar el análisis de genotipado conjunto propiamente dicho para generar el VCF final de variantes llamadas conjuntamente.

2.3.1. Combinar todos los GVCFs por muestra

Este primer paso usa otra herramienta de GATK, llamada GenomicsDBImport, para combinar los datos de todos los GVCFs en un almacén de datos GenomicsDB. El almacén de datos GenomicsDB es una especie de formato de base de datos que sirve como almacenamiento intermedio para la información de variantes.

gatk GenomicsDBImport \
    -V reads_mother.g.vcf \
    -V reads_father.g.vcf \
    -V reads_son.g.vcf \
    -L /data/ref/intervals.bed \
    --genomicsdb-workspace-path family_trio_gdb
Salida del comando 
Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar GenomicsDBImport -V reads_mother.g.vcf -V reads_father.g.vcf -V reads_son.g.vcf -L /data/ref/intervals.bed --genomicsdb-workspace-path family_trio_gdb
17:37:07.569 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
17:37:07.699 INFO  GenomicsDBImport - ------------------------------------------------------------
17:37:07.702 INFO  GenomicsDBImport - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
17:37:07.702 INFO  GenomicsDBImport - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
17:37:07.703 INFO  GenomicsDBImport - Executing as root@be1a0302f6c7 on Linux v6.8.0-1030-azure amd64
17:37:07.703 INFO  GenomicsDBImport - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
17:37:07.704 INFO  GenomicsDBImport - Start Date/Time: February 11, 2026 at 5:37:07 PM GMT
17:37:07.704 INFO  GenomicsDBImport - ------------------------------------------------------------
17:37:07.704 INFO  GenomicsDBImport - ------------------------------------------------------------
17:37:07.706 INFO  GenomicsDBImport - HTSJDK Version: 4.1.0
17:37:07.706 INFO  GenomicsDBImport - Picard Version: 3.1.1
17:37:07.707 INFO  GenomicsDBImport - Built for Spark Version: 3.5.0
17:37:07.709 INFO  GenomicsDBImport - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
17:37:07.709 INFO  GenomicsDBImport - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
17:37:07.709 INFO  GenomicsDBImport - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
17:37:07.710 INFO  GenomicsDBImport - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
17:37:07.710 INFO  GenomicsDBImport - Deflater: IntelDeflater
17:37:07.711 INFO  GenomicsDBImport - Inflater: IntelInflater
17:37:07.711 INFO  GenomicsDBImport - GCS max retries/reopens: 20
17:37:07.711 INFO  GenomicsDBImport - Requester pays: disabled
17:37:07.712 INFO  GenomicsDBImport - Initializing engine
17:37:07.883 INFO  FeatureManager - Using codec BEDCodec to read file file:///data/ref/intervals.bed
17:37:07.886 INFO  IntervalArgumentCollection - Processing 6369 bp from intervals
17:37:07.889 INFO  GenomicsDBImport - Done initializing engine
17:37:08.560 INFO  GenomicsDBLibLoader - GenomicsDB native library version : 1.5.1-84e800e
17:37:08.561 INFO  GenomicsDBImport - Vid Map JSON file will be written to /tmp/family_trio_gdb/vidmap.json
17:37:08.561 INFO  GenomicsDBImport - Callset Map JSON file will be written to /tmp/family_trio_gdb/callset.json
17:37:08.561 INFO  GenomicsDBImport - Complete VCF Header will be written to /tmp/family_trio_gdb/vcfheader.vcf
17:37:08.561 INFO  GenomicsDBImport - Importing to workspace - /tmp/family_trio_gdb
17:37:08.878 INFO  GenomicsDBImport - Importing batch 1 with 3 samples
17:37:09.359 INFO  GenomicsDBImport - Importing batch 1 with 3 samples
17:37:09.487 INFO  GenomicsDBImport - Importing batch 1 with 3 samples
17:37:09.591 INFO  GenomicsDBImport - Done importing batch 1/1
17:37:09.592 INFO  GenomicsDBImport - Import completed!
17:37:09.592 INFO  GenomicsDBImport - Shutting down engine
[February 11, 2026 at 5:37:09 PM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.genomicsdb.GenomicsDBImport done. Elapsed time: 0.03 minutes.
Runtime.totalMemory()=113246208
Tool returned:
true

La salida de este paso es efectivamente un directorio que contiene un conjunto de directorios anidados adicionales que contienen los datos de variantes combinados en forma de múltiples archivos diferentes. Puedes explorarlo pero rápidamente verás que este formato de almacén de datos no está diseñado para ser leído directamente por humanos.

Consejo

GATK incluye herramientas que hacen posible inspeccionar y extraer datos de llamados de variantes del almacén de datos según sea necesario.

2.3.2. Ejecutar el análisis de genotipado conjunto propiamente dicho

Este segundo paso usa otra herramienta de GATK, llamada GenotypeGVCFs, para recalcular las estadísticas de variantes y los genotipos individuales a la luz de los datos disponibles en todas las muestras de la cohorte.

gatk GenotypeGVCFs \
    -R /data/ref/ref.fasta \
    -V gendb://family_trio_gdb \
    -O family_trio.vcf
Salida del comando 
Using GATK jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar
Running:
    java -Dsamjdk.use_async_io_read_samtools=false -Dsamjdk.use_async_io_write_samtools=true -Dsamjdk.use_async_io_write_tribble=false -Dsamjdk.compression_level=2 -jar /opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar GenotypeGVCFs -R /data/ref/ref.fasta -V gendb://family_trio_gdb -O family_trio.vcf
17:38:45.084 INFO  NativeLibraryLoader - Loading libgkl_compression.so from jar:file:/opt/conda/share/gatk4-4.5.0.0-0/gatk-package-4.5.0.0-local.jar!/com/intel/gkl/native/libgkl_compression.so
17:38:45.217 INFO  GenotypeGVCFs - ------------------------------------------------------------
17:38:45.220 INFO  GenotypeGVCFs - The Genome Analysis Toolkit (GATK) v4.5.0.0
17:38:45.220 INFO  GenotypeGVCFs - For support and documentation go to https://software.broadinstitute.org/gatk/
17:38:45.220 INFO  GenotypeGVCFs - Executing as root@be1a0302f6c7 on Linux v6.8.0-1030-azure amd64
17:38:45.220 INFO  GenotypeGVCFs - Java runtime: OpenJDK 64-Bit Server VM v17.0.11-internal+0-adhoc..src
17:38:45.221 INFO  GenotypeGVCFs - Start Date/Time: February 11, 2026 at 5:38:45 PM GMT
17:38:45.221 INFO  GenotypeGVCFs - ------------------------------------------------------------
17:38:45.221 INFO  GenotypeGVCFs - ------------------------------------------------------------
17:38:45.221 INFO  GenotypeGVCFs - HTSJDK Version: 4.1.0
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - Picard Version: 3.1.1
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - Built for Spark Version: 3.5.0
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - HTSJDK Defaults.COMPRESSION_LEVEL : 2
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_READ_FOR_SAMTOOLS : false
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_SAMTOOLS : true
17:38:45.222 INFO  GenotypeGVCFs - HTSJDK Defaults.USE_ASYNC_IO_WRITE_FOR_TRIBBLE : false
17:38:45.223 INFO  GenotypeGVCFs - Deflater: IntelDeflater
17:38:45.223 INFO  GenotypeGVCFs - Inflater: IntelInflater
17:38:45.223 INFO  GenotypeGVCFs - GCS max retries/reopens: 20
17:38:45.223 INFO  GenotypeGVCFs - Requester pays: disabled
17:38:45.223 INFO  GenotypeGVCFs - Initializing engine
17:38:45.544 INFO  GenomicsDBLibLoader - GenomicsDB native library version : 1.5.1-84e800e
17:38:45.561 INFO  NativeGenomicsDB - pid=221 tid=222 No valid combination operation found for INFO field InbreedingCoeff  - the field will NOT be part of INFO fields in the generated VCF records
17:38:45.561 INFO  NativeGenomicsDB - pid=221 tid=222 No valid combination operation found for INFO field MLEAC  - the field will NOT be part of INFO fields in the generated VCF records
17:38:45.561 INFO  NativeGenomicsDB - pid=221 tid=222 No valid combination operation found for INFO field MLEAF  - the field will NOT be part of INFO fields in the generated VCF records
17:38:45.577 INFO  GenotypeGVCFs - Done initializing engine
17:38:45.615 INFO  ProgressMeter - Starting traversal
17:38:45.615 INFO  ProgressMeter -        Current Locus  Elapsed Minutes    Variants Processed  Variants/Minute
17:38:45.903 WARN  InbreedingCoeff - InbreedingCoeff will not be calculated at position 20_10037292_10066351:3480 and possibly subsequent; at least 10 samples must have called genotypes
GENOMICSDB_TIMER,GenomicsDB iterator next() timer,Wall-clock time(s),0.07757032800000006,Cpu time(s),0.07253379200000037
17:38:46.421 INFO  ProgressMeter - 20_10037292_10066351:13953              0.0                  3390         252357.3
17:38:46.422 INFO  ProgressMeter - Traversal complete. Processed 3390 total variants in 0.0 minutes.
17:38:46.423 INFO  GenotypeGVCFs - Shutting down engine
[February 11, 2026 at 5:38:46 PM GMT] org.broadinstitute.hellbender.tools.walkers.GenotypeGVCFs done. Elapsed time: 0.02 minutes.
Runtime.totalMemory()=203423744

Esto crea el archivo de salida VCF family_trio.vcf en el directorio de trabajo actual en el contenedor, así como su índice, family_trio.vcf.idx. Es otro archivo razonablemente pequeño, así que puedes ejecutar cat family_trio.vcf para ver el contenido del archivo, y desplazarte hacia abajo para encontrar las primeras líneas de variantes.

Contenidos del archivo (abreviado)
family_trio.vcf
 1
 2
 3
 4
 5
 6
 7
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51
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53
54
55
56
57
58
##fileformat=VCFv4.2
##ALT=<ID=NON_REF,Description="Represents any possible alternative allele not already represented at this location by REF and ALT">
##FILTER=<ID=LowQual,Description="Low quality">
##FILTER=<ID=PASS,Description="All filters passed">
##FORMAT=<ID=AD,Number=R,Type=Integer,Description="Allelic depths for the ref and alt alleles in the order listed">
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth (reads with MQ=255 or with bad mates are filtered)">
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">
##FORMAT=<ID=MIN_DP,Number=1,Type=Integer,Description="Minimum DP observed within the GVCF block">
##FORMAT=<ID=PGT,Number=1,Type=String,Description="Physical phasing haplotype information, describing how the alternate alleles are phased in relation to one another; will always be heterozygous and is not intended to describe called alleles">
##FORMAT=<ID=PID,Number=1,Type=String,Description="Physical phasing ID information, where each unique ID within a given sample (but not across samples) connects records within a phasing group">
##FORMAT=<ID=PL,Number=G,Type=Integer,Description="Normalized, Phred-scaled likelihoods for genotypes as defined in the VCF specification">
##FORMAT=<ID=PS,Number=1,Type=Integer,Description="Phasing set (typically the position of the first variant in the set)">
##FORMAT=<ID=RGQ,Number=1,Type=Integer,Description="Unconditional reference genotype confidence, encoded as a phred quality -10*log10 p(genotype call is wrong)">
##FORMAT=<ID=SB,Number=4,Type=Integer,Description="Per-sample component statistics which comprise the Fisher's Exact Test to detect strand bias.">
##GATKCommandLine=<ID=GenomicsDBImport,CommandLine="GenomicsDBImport --genomicsdb-workspace-path family_trio_gdb --variant reads_mother.g.vcf --variant reads_father.g.vcf --variant reads_son.g.vcf --intervals /data/ref/intervals.bed [abreviado]",Version="4.5.0.0",Date="February 11, 2026 at 5:37:07 PM GMT">
##GATKCommandLine=<ID=GenotypeGVCFs,CommandLine="GenotypeGVCFs --output family_trio.vcf --variant gendb://family_trio_gdb --reference /data/ref/ref.fasta --include-non-variant-sites false [abreviado]",Version="4.5.0.0",Date="February 11, 2026 at 5:38:45 PM GMT">
##GATKCommandLine=<ID=HaplotypeCaller,CommandLine="HaplotypeCaller --emit-ref-confidence GVCF --output reads_mother.g.vcf --intervals /data/ref/intervals.bed --input /data/bam/reads_mother.bam --reference /data/ref/ref.fasta [abreviado]",Version="4.5.0.0",Date="February 11, 2026 at 4:51:00 PM GMT">
##INFO=<ID=AC,Number=A,Type=Integer,Description="Allele count in genotypes, for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=AF,Number=A,Type=Float,Description="Allele Frequency, for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=AN,Number=1,Type=Integer,Description="Total number of alleles in called genotypes">
##INFO=<ID=BaseQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt Vs. Ref base qualities">
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Approximate read depth; some reads may have been filtered">
##INFO=<ID=END,Number=1,Type=Integer,Description="Stop position of the interval">
##INFO=<ID=ExcessHet,Number=1,Type=Float,Description="Phred-scaled p-value for exact test of excess heterozygosity">
##INFO=<ID=FS,Number=1,Type=Float,Description="Phred-scaled p-value using Fisher's exact test to detect strand bias">
##INFO=<ID=InbreedingCoeff,Number=1,Type=Float,Description="Inbreeding coefficient as estimated from the genotype likelihoods per-sample when compared against the Hardy-Weinberg expectation">
##INFO=<ID=MLEAC,Number=A,Type=Integer,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele counts (not necessarily the same as the AC), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MLEAF,Number=A,Type=Float,Description="Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele frequency (not necessarily the same as the AF), for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=MQ,Number=1,Type=Float,Description="RMS Mapping Quality">
##INFO=<ID=MQRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score From Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read mapping qualities">
##INFO=<ID=QD,Number=1,Type=Float,Description="Variant Confidence/Quality by Depth">
##INFO=<ID=RAW_MQandDP,Number=2,Type=Integer,Description="Raw data (sum of squared MQ and total depth) for improved RMS Mapping Quality calculation. Incompatible with deprecated RAW_MQ formulation.">
##INFO=<ID=ReadPosRankSum,Number=1,Type=Float,Description="Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read position bias">
##INFO=<ID=SOR,Number=1,Type=Float,Description="Symmetric Odds Ratio of 2x2 contingency table to detect strand bias">
##contig=<ID=20_10037292_10066351,length=29059>
##source=GenomicsDBImport
##source=GenotypeGVCFs
##source=HaplotypeCaller
#CHROM  POS     ID      REF     ALT     QUAL    FILTER  INFO    FORMAT  reads_father    reads_mother    reads_son
20_10037292_10066351    3480    .       C       CT      1625.89 .       AC=5;AF=0.833;AN=6;BaseQRankSum=0.220;DP=85;ExcessHet=0.0000;FS=2.476;MLEAC=5;MLEAF=0.833;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=21.68;ReadPosRankSum=-1.147e+00;SOR=0.487    GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:15,16:31:99:367,0,375       1/1:0,18:18:54:517,54,0 1/1:0,26:26:78:756,78,0
20_10037292_10066351    3520    .       AT      A       1678.89 .       AC=5;AF=0.833;AN=6;BaseQRankSum=1.03;DP=80;ExcessHet=0.0000;FS=2.290;MLEAC=5;MLEAF=0.833;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=22.39;ReadPosRankSum=0.701;SOR=0.730  GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:18,13:31:99:296,0,424       1/1:0,18:18:54:623,54,0 1/1:0,26:26:78:774,78,0
20_10037292_10066351    3529    .       T       A       154.29  .       AC=1;AF=0.167;AN=6;BaseQRankSum=-5.440e-01;DP=104;ExcessHet=0.0000;FS=1.871;MLEAC=1;MLEAF=0.167;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=7.71;ReadPosRankSum=-1.158e+00;SOR=1.034       GT:AD:DP:GQ:PL  0/0:44,0:44:99:0,112,1347       0/1:12,8:20:99:163,0,328        0/0:39,0:39:99:0,105,1194
20_10037292_10066351    4012    .       C       T       3950.73 .       AC=6;AF=1.00;AN=6;DP=127;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=6;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=31.86;SOR=0.725    GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,46:46:99:1446,137,0   1/1:0,43:43:99:1412,129,0        1/1:0,35:35:99:1106,105,0
20_10037292_10066351    4409    .       A       ATATG   2478.69 .       AC=6;AF=1.00;AN=6;DP=96;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=6;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=33.95;SOR=0.963     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,28:28:90:969,90,0 1/1:0,21:21:69:724,69,0      1/1:0,24:24:72:799,72,0
20_10037292_10066351    4464    .       T       TA      620.25  .       AC=1;AF=0.167;AN=6;BaseQRankSum=0.108;DP=102;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=1;MLEAF=0.167;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=19.38;ReadPosRankSum=1.27;SOR=0.892 GT:AD:DP:GQ:PGT:PID:PL:PS       0|1:15,17:32:99:0|1:4464_T_TA:629,0,554:4464    0/0:30,0:30:78:.:.:0,78,1170 0/0:39,0:39:99:.:.:0,108,1286
20_10037292_10066351    4465    .       T       TA      620.25  .       AC=1;AF=0.167;AN=6;BaseQRankSum=-2.250e-01;DP=101;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=1;MLEAF=0.167;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=19.38;ReadPosRankSum=0.910;SOR=0.892   GT:AD:DP:GQ:PGT:PID:PL:PS       0|1:15,17:32:99:0|1:4464_T_TA:629,0,554:4464    0/0:30,0:30:78:.:.:0,78,1170 0/0:39,0:39:99:.:.:0,108,1286
20_10037292_10066351    5027    .       C       T       3339.73 .       AC=6;AF=1.00;AN=6;DP=108;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=6;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=31.51;SOR=0.731    GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,36:36:99:1164,108,0   1/1:0,26:26:77:798,77,0  1/1:0,44:44:99:1391,132,0
20_10037292_10066351    5469    .       A       G       2725.93 .       AC=5;AF=0.833;AN=6;BaseQRankSum=-3.665e+00;DP=113;ExcessHet=0.0000;FS=6.914;MLEAC=5;MLEAF=0.833;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=24.34;ReadPosRankSum=1.50;SOR=0.320    GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:18,23:41:99:553,0,486       1/1:0,42:42:99:1311,126,0       1/1:0,29:29:86:876,86,0
20_10037292_10066351    7557    .       A       G       2257.93 .       AC=5;AF=0.833;AN=6;BaseQRankSum=-1.362e+00;DP=111;ExcessHet=0.0000;FS=3.400;MLEAC=5;MLEAF=0.833;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=21.50;ReadPosRankSum=1.11;SOR=0.566    GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:19,15:34:99:313,0,493       1/1:0,34:34:99:949,100,0        1/1:0,37:37:99:1010,108,0
20_10037292_10066351    7786    .       G       T       3503.73 .       AC=6;AF=1.00;AN=6;DP=114;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=6;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=31.28;SOR=0.970    GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,34:34:99:1066,102,0   1/1:0,34:34:99:1057,102,0        1/1:0,44:44:99:1394,132,0
20_10037292_10066351    8350    .       G       C       2663.93 .       AC=5;AF=0.833;AN=6;BaseQRankSum=-1.608e+00;DP=106;ExcessHet=0.0000;FS=5.378;MLEAC=5;MLEAF=0.833;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=25.37;ReadPosRankSum=-1.870e-01;SOR=0.950      GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:16,14:30:99:356,0,430       1/1:0,39:39:99:1176,115,0       1/1:0,36:36:99:1146,108,0
20_10037292_10066351    8886    .       AAGAAAGAAAG     A       3037.69 .       AC=6;AF=1.00;AN=6;DP=89;ExcessHet=0.0000;FS=0.000;MLEAC=6;MLEAF=1.00;MQ=60.00;QD=25.36;SOR=2.269     GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,18:18:55:804,55,0      1/1:0,29:29:88:1282,88,0        1/1:0,22:22:67:965,67,0
20_10037292_10066351    9536    .       T       C       1089.95 .       AC=3;AF=0.500;AN=6;BaseQRankSum=-5.640e-01;DP=82;ExcessHet=0.0000;FS=12.258;MLEAC=3;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=20.57;ReadPosRankSum=0.860;SOR=0.373   GT:AD:DP:GQ:PL  1/1:0,32:32:95:950,95,0 0/0:29,0:29:81:0,81,1215        0/1:14,7:21:99:156,0,353
20_10037292_10066351    13375   .       C       T       724.29  .       AC=1;AF=0.167;AN=6;BaseQRankSum=0.171;DP=121;ExcessHet=0.0000;FS=7.398;MLEAC=1;MLEAF=0.167;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=12.71;ReadPosRankSum=0.415;SOR=1.688        GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:28,29:57:99:733,0,679       0/0:29,0:29:81:0,81,1215        0/0:34,0:34:99:0,99,1485
20_10037292_10066351    13536   .       T       C       1025.16 .       AC=2;AF=0.333;AN=6;BaseQRankSum=1.63;DP=118;ExcessHet=0.9691;FS=1.719;MLEAC=2;MLEAF=0.333;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=11.65;ReadPosRankSum=-2.000e-01;SOR=0.904    GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:21,23:44:99:591,0,526       0/1:26,18:44:99:445,0,672       0/0:29,0:29:84:0,84,1260
20_10037292_10066351    14156   .       T       C       438.16  .       AC=2;AF=0.333;AN=6;BaseQRankSum=3.20;DP=96;ExcessHet=0.9691;FS=2.381;MLEAC=2;MLEAF=0.333;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=7.82;ReadPosRankSum=1.13;SOR=0.592    GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:25,11:36:99:258,0,676       0/1:12,8:20:99:191,0,319        0/0:38,0:38:99:0,99,1117
20_10037292_10066351    14403   .       G       A       144.29  .       AC=1;AF=0.167;AN=6;BaseQRankSum=2.63;DP=116;ExcessHet=0.0000;FS=1.435;MLEAC=1;MLEAF=0.167;MQ=60.00;MQRankSum=0.00;QD=3.52;ReadPosRankSum=0.252;SOR=0.802  GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:32,9:41:99:153,0,821        0/0:37,0:37:99:0,109,1169       0/0:37,0:37:99:0,99,1113

Hemos resaltado una vez más la última línea del encabezado, que marca el inicio de los datos de llamados de variantes.

Esto se ve similar al VCF que generamos anteriormente, excepto que esta vez tenemos información a nivel de genotipo para las tres muestras. Las últimas tres columnas en el archivo son los bloques de genotipo para las muestras, listados en orden alfabético de su campo ID, como se muestra en la línea de encabezado resaltada.

Si observamos los genotipos llamados para nuestro trío familiar de prueba para la primera variante, vemos que el padre es heterocigoto-variante (0/1), y la madre y el hijo son ambos homocigotos-variante (1/1).

¡Esa es en última instancia la información que estamos buscando extraer del conjunto de datos!

2.3.3. Mover los archivos de salida

Como se mencionó anteriormente, cualquier cosa que permanezca dentro del contenedor será inaccesible para trabajo futuro. Antes de salir del contenedor, vamos a mover los archivos GVCF, el VCF final multi-muestra y todos sus archivos índice manualmente al sistema de archivos fuera del contenedor. De esa manera, tendremos algo con qué comparar cuando construyamos nuestro workflow para automatizar todo este trabajo.

mv *.vcf* /data/vcf
Contenidos del directorio" hl_lines="14-19 22-23 
data
├── bam
│   ├── reads_father.bam
│   ├── reads_father.bam.bai
│   ├── reads_mother.bam
│   ├── reads_mother.bam.bai
│   ├── reads_son.bam
│   └── reads_son.bam.bai
├── ref
│   ├── intervals.bed
│   ├── ref.dict
│   ├── ref.fasta
│   └── ref.fasta.fai
├── samplesheet.csv
└── vcf
    ├── family_trio.vcf
    ├── family_trio.vcf.idx
    ├── reads_father.g.vcf
    ├── reads_father.g.vcf.idx
    ├── reads_mother.g.vcf
    ├── reads_mother.g.vcf.idx
    ├── reads_mother.vcf
    ├── reads_mother.vcf.idx
    ├── reads_son.g.vcf
    └── reads_son.g.vcf.idx

Una vez hecho esto, todos los archivos ahora son accesibles en tu sistema de archivos normal.

2.3.4. Salir del contenedor de GATK

Para salir del contenedor, escribe exit.

exit

Tu prompt debería volver a la normalidad. Eso concluye las pruebas manuales de los comandos de llamado conjunto de variantes.

Conclusión

Sabes cómo probar los comandos de indexación de Samtools y llamado de variantes de GATK en sus respectivos contenedores, incluyendo cómo generar GVCFs y ejecutar el genotipado conjunto en múltiples muestras.

¿Qué sigue?

Toma un descanso, luego dirígete a la Parte 2 para aprender cómo envolver esos mismos comandos en workflows que usan contenedores para ejecutar el trabajo.