Parte 2: Implementación de muestra única¶

Traducción asistida por IA - más información y sugerencias

En esta parte del curso, vamos a escribir el flujo de trabajo más simple posible que envuelva todos los comandos que ejecutamos en la Parte 1 para automatizar su ejecución, y nos enfocaremos en procesar una muestra a la vez.

Haremos esto en tres etapas:

Escribir un flujo de trabajo de una sola etapa que ejecute el paso inicial de control de calidad
Agregar el recorte de adaptadores y el control de calidad posterior al recorte
Agregar alineamiento al genoma de referencia

Requisito previo

Debe completar la Parte 1 del curso antes de comenzar esta lección. Específicamente, trabajar en las secciones 2.1-3 crea el archivo de índice del genoma (data/genome_index.tar.gz) requerido para el paso de alineamiento en esta lección.

1. Escribir un flujo de trabajo de una sola etapa que ejecute el control de calidad inicial¶

Comencemos escribiendo un flujo de trabajo simple que ejecute la herramienta FastQC en un archivo FASTQ que contenga lecturas de RNAseq de extremo simple.

Le proporcionamos un archivo de flujo de trabajo, rnaseq.nf, que describe las partes principales del flujo de trabajo.

rnaseq.nf
#!/usr/bin/env nextflow

// Declaraciones de inclusión de módulos

/*
 * Pipeline parameters
 */

// Entrada principal

workflow {

    // Crear canal de entrada

    // Llamar procesos

}

Tenga en cuenta que este código de flujo de trabajo es correcto pero no es funcional; su propósito es solo servir como esqueleto que usará para escribir el flujo de trabajo real.

1.1. Crear un directorio para almacenar módulos¶

Crearemos módulos independientes para cada proceso para facilitar su gestión y reutilización, así que creemos un directorio para almacenarlos.

mkdir modules

1.2. Crear un módulo para el proceso de recolección de métricas de control de calidad¶

Creemos un archivo de módulo llamado modules/fastqc.nf para alojar el proceso FASTQC:

touch modules/fastqc.nf

Abra el archivo en el editor de código y copie el siguiente código en él:

modules/fastqc.nf
#!/usr/bin/env nextflow

process FASTQC {

    container "community.wave.seqera.io/library/trim-galore:0.6.10--1bf8ca4e1967cd18"
    publishDir "results/fastqc", mode: 'symlink'

    input:
    path reads

    output:
    path "${reads.simpleName}_fastqc.zip", emit: zip
    path "${reads.simpleName}_fastqc.html", emit: html

    script:
    """
    fastqc $reads
    """
}

Debería reconocer todas las piezas de lo que aprendió en la Parte 1 y Parte 2 de esta serie de entrenamiento; el único cambio notable es que esta vez estamos usando mode: symlink para la directiva publishDir, y estamos usando un parámetro para definir el publishDir.

Nota

Aunque los archivos de datos que estamos usando aquí son muy pequeños, en genómica pueden volverse muy grandes. Para fines de demostración en el entorno de enseñanza, estamos usando el modo de publicación 'symlink' para evitar copias de archivos innecesarias. No debería hacer esto en sus flujos de trabajo finales, ya que perderá resultados cuando limpie su directorio work.

1.3. Importar el módulo en el archivo de flujo de trabajo¶

Agregue la declaración include { FASTQC } from './modules/fastqc.nf' al archivo rnaseq.nf:

rnaseq.nf
// Declaraciones de inclusión de módulos
include { FASTQC } from './modules/fastqc.nf'

1.4. Agregar una declaración de entrada¶

Declare un parámetro de entrada con un valor predeterminado:

rnaseq.nf
params {
    // Entrada principal
    reads: Path = "data/reads/ENCSR000COQ1_1.fastq.gz"
}

1.5. Crear un canal de entrada en el bloque workflow¶

Use una fábrica de canal básica .fromPath() para crear el canal de entrada:

rnaseq.nf
workflow {

    // Crear canal de entrada from a file path
    read_ch = channel.fromPath(params.reads)

    // Llamar procesos

}

1.6. Llamar al proceso `FASTQC` en el canal de entrada¶

rnaseq.nf
workflow {

    // Crear canal de entrada from a file path
    read_ch = channel.fromPath(params.reads)

    // Initial quality control
    FASTQC(read_ch)

}

1.7. Ejecutar el flujo de trabajo para verificar que funciona¶

Podríamos usar el parámetro --reads para especificar una entrada desde la línea de comandos, pero durante el desarrollo podemos ser perezosos y simplemente usar el valor predeterminado de prueba que configuramos.

nextflow run rnaseq.nf

Salida del comando

N E X T F L O W   ~  version 24.10.0

Launching `rnaseq.nf` [fabulous_snyder] DSL2 - revision: 3394c725ee

executor >  local (1)
[d6/d94c3a] FASTQC (1) [100%] 1 of 1 ✔

Esto debería ejecutarse muy rápidamente si trabajó en la Parte 1 y ya ha descargado el contenedor. Si la omitió, Nextflow descargará el contenedor por usted; no tiene que hacer nada para que suceda, pero es posible que deba esperar hasta un minuto.

Puede encontrar las salidas bajo results/fastqc como se especifica en el proceso FASTQC por la directiva publishDir.

ls results/fastqc

Salida

ENCSR000COQ1_1_fastqc.html  ENCSR000COQ1_1_fastqc.zip

2. Agregar recorte de adaptadores y control de calidad posterior al recorte¶

Vamos a usar el envoltorio Trim_Galore, que incluye Cutadapt para el recorte en sí y FastQC para el control de calidad posterior al recorte.

2.1. Crear un módulo para el proceso de recorte y control de calidad¶

Creemos un archivo de módulo llamado modules/trim_galore.nf para alojar el proceso TRIM_GALORE:

touch modules/trim_galore.nf

Abra el archivo en el editor de código y copie el siguiente código en él:

modules/trim_galore.nf
#!/usr/bin/env nextflow

process TRIM_GALORE {

    container "community.wave.seqera.io/library/trim-galore:0.6.10--1bf8ca4e1967cd18"
    publishDir "results/trimming", mode: 'symlink'

    input:
    path reads

    output:
    path "${reads.simpleName}_trimmed.fq.gz", emit: trimmed_reads
    path "${reads}_trimming_report.txt", emit: trimming_reports
    path "${reads.simpleName}_trimmed_fastqc.{zip,html}", emit: fastqc_reports

    script:
    """
    trim_galore --fastqc $reads
    """
}

2.2. Importar el módulo en el archivo de flujo de trabajo¶

Agregue la declaración include { TRIM_GALORE } from './modules/trim_galore.nf' al archivo rnaseq.nf:

rnaseq.nf
// Declaraciones de inclusión de módulos
include { FASTQC } from './modules/fastqc.nf'
include { TRIM_GALORE } from './modules/trim_galore.nf'

2.3. Llamar al proceso en el canal de entrada¶

rnaseq.nf
workflow {

    // Crear canal de entrada from a file path
    read_ch = channel.fromPath(params.reads)

    // Initial quality control
    FASTQC(read_ch)

    // Adapter trimming and post-trimming QC
    TRIM_GALORE(read_ch)
}

2.4. Ejecutar el flujo de trabajo para verificar que funciona¶

nextflow run rnaseq.nf

Salida del comando

N E X T F L O W   ~  version 24.10.0

Launching `rnaseq.nf` [fabulous_snyder] DSL2 - revision: 3394c725ee

executor >  local (1)
[d6/d94c3a] FASTQC (1) [100%] 1 of 1 ✔
[c2/e4a9bb] TRIM_GALORE (1)  [100%] 1 of 1 ✔

Esto también debería ejecutarse muy rápidamente, ya que estamos ejecutando en un archivo de entrada tan pequeño.

Puede encontrar las salidas bajo results/trimming como se especifica en el proceso TRIM_GALORE por la directiva publishDir.

ls results/trimming

Salida

ENCSR000COQ1_1.fastq.gz_trimming_report.txt  ENCSR000COQ1_1_trimmed_fastqc.zip
ENCSR000COQ1_1_trimmed_fastqc.html           ENCSR000COQ1_1_trimmed.fq.gz

3. Alinear las lecturas al genoma de referencia¶

Finalmente podemos ejecutar el paso de alineamiento del genoma usando Hisat2, que también emitirá métricas de control de calidad al estilo FastQC.

3.1. Crear un módulo para el proceso HiSat2¶

Creemos un archivo de módulo llamado modules/hisat2_align.nf para alojar el proceso HISAT2_ALIGN:

touch modules/hisat2_align.nf

Abra el archivo en el editor de código y copie el siguiente código en él:

modules/hisat2_align.nf
#!/usr/bin/env nextflow

process HISAT2_ALIGN {

    container "community.wave.seqera.io/library/hisat2_samtools:5e49f68a37dc010e"
    publishDir "results/align", mode: 'symlink'

    input:
    path reads
    path index_zip

    output:
    path "${reads.simpleName}.bam", emit: bam
    path "${reads.simpleName}.hisat2.log", emit: log

    script:
    """
    tar -xzvf $index_zip
    hisat2 -x ${index_zip.simpleName} -U $reads \
        --new-summary --summary-file ${reads.simpleName}.hisat2.log | \
        samtools view -bS -o ${reads.simpleName}.bam
    """
}

3.2. Importar el módulo en el archivo de flujo de trabajo¶

Agregue la declaración include { HISAT2_ALIGN } from './modules/hisat2_align.nf' al archivo rnaseq.nf:

rnaseq.nf
// Declaraciones de inclusión de módulos
include { FASTQC } from './modules/fastqc.nf'
include { TRIM_GALORE } from './modules/trim_galore.nf'
include { HISAT2_ALIGN } from './modules/hisat2_align.nf'

3.3. Agregar una declaración de parámetro para proporcionar el índice del genoma¶

Declare un parámetro de entrada con un valor predeterminado:

rnaseq.nf
params {
    // Entrada principal
    reads: Path = "data/reads/ENCSR000COQ1_1.fastq.gz"

    // Reference genome archive
    hisat2_index_zip: Path = "data/genome_index.tar.gz"
}

3.4. Llamar al proceso `HISAT2_ALIGN` en las lecturas recortadas de salida de `TRIM_GALORE`¶

Las lecturas recortadas están en el canal TRIM_GALORE.out.trimmed_reads de salida del paso anterior.

Además, usamos file (params.hisat2_index_zip) para proporcionar a la herramienta Hisat2 el archivo tarball comprimido del índice del genoma.

rnaseq.nf
workflow {

    // Crear canal de entrada from a file path
    read_ch = channel.fromPath(params.reads)

    // Initial quality control
    FASTQC(read_ch)

    // Adapter trimming and post-trimming QC
    TRIM_GALORE(read_ch)

    // Alineamiento a un genoma de referencia
    HISAT2_ALIGN(TRIM_GALORE.out.trimmed_reads, file (params.hisat2_index_zip))
}

3.5. Ejecutar el flujo de trabajo para verificar que funciona¶

nextflow run rnaseq.nf

Salida del comando

N E X T F L O W   ~  version 24.10.0

Launching `rnaseq.nf` [extravagant_khorana] DSL2 - revision: 701b41bd16

executor >  local (3)
[e4/d15ad4] FASTQC (1)       [100%] 1 of 1 ✔
[c6/12b2be] TRIM_GALORE (1)  [100%] 1 of 1 ✔
[c6/7a9f13] HISAT2_ALIGN (1) [100%] 1 of 1 ✔

Puede encontrar las salidas bajo results/align como se especifica en el proceso HISAT2_ALIGN por la directiva publishDir.

ls results/align

Salida

ENCSR000COQ1_1_trimmed.bam  ENCSR000COQ1_1_trimmed.hisat2.log

Esto completa el procesamiento básico que necesitamos aplicar a cada muestra.

Agregaremos la agregación de informes MultiQC en la Parte 2, después de que hayamos modificado el flujo de trabajo para aceptar múltiples muestras a la vez.

Conclusión¶

Sabe cómo envolver todos los pasos principales para procesar muestras de RNAseq de extremo simple individualmente.

¿Qué sigue?¶

Aprenda cómo modificar el flujo de trabajo para procesar múltiples muestras en paralelo, agregar informes de control de calidad en todos los pasos para todas las muestras, y habilitar la ejecución del flujo de trabajo en datos de RNAseq de extremo pareado.

Parte 2: Implementación de muestra única¶

1. Escribir un flujo de trabajo de una sola etapa que ejecute el control de calidad inicial¶

1.1. Crear un directorio para almacenar módulos¶

1.2. Crear un módulo para el proceso de recolección de métricas de control de calidad¶

1.3. Importar el módulo en el archivo de flujo de trabajo¶

1.4. Agregar una declaración de entrada¶

1.5. Crear un canal de entrada en el bloque workflow¶

1.6. Llamar al proceso FASTQC en el canal de entrada¶

1.7. Ejecutar el flujo de trabajo para verificar que funciona¶

2. Agregar recorte de adaptadores y control de calidad posterior al recorte¶

2.1. Crear un módulo para el proceso de recorte y control de calidad¶

2.2. Importar el módulo en el archivo de flujo de trabajo¶

2.3. Llamar al proceso en el canal de entrada¶

2.4. Ejecutar el flujo de trabajo para verificar que funciona¶

3. Alinear las lecturas al genoma de referencia¶

3.1. Crear un módulo para el proceso HiSat2¶

3.2. Importar el módulo en el archivo de flujo de trabajo¶

3.3. Agregar una declaración de parámetro para proporcionar el índice del genoma¶

3.4. Llamar al proceso HISAT2_ALIGN en las lecturas recortadas de salida de TRIM_GALORE¶

3.5. Ejecutar el flujo de trabajo para verificar que funciona¶

Conclusión¶

¿Qué sigue?¶

1.6. Llamar al proceso `FASTQC` en el canal de entrada¶

3.4. Llamar al proceso `HISAT2_ALIGN` en las lecturas recortadas de salida de `TRIM_GALORE`¶